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Articles by Rita Marouga in JoVE
JoVE General
CyDye DIGEフルーア最小限の色素を用いた細胞表面タンパク質の選択的ラベリング
Research and Development, GE Healthcare Bio-Sciences AB
シンプルで具体的な方法は、分別工程なしで蛍光標識し、細胞表面タンパク質の拡張検出用に実証された。細胞表面タンパク質の差の存在量は、（2 - D）二次元電気泳動とEttan™DIGE技術を用いて解析した。
Other articles by Rita Marouga on PubMed
In Vitroで選択されたハンマーヘッドリボザイムの持つE6AP遺伝子抑制とキャラクタリゼーション
E6APは、もともとヒトパピローマウイルス（HPV）E6媒介p53の分解に関与するユビキチン - タンパク質リガーゼとして同定されて以来、いくつかの他のタンパク質基質のユビキチン化のE3ユビキチン - タンパク質リガーゼとして作用することが示されています。さらに、分子および細胞レベルでE6AP関数を定義するために、リボザイムによる遺伝子不活化のアプローチが採用されました。無作為アーム配列を有するハンマーヘッド型リボザイム、のライブラリは、リボザイム切断サイトの全体E6APのトランスクリプトに沿って活性分子をスクリーニングするために使用されていました。ライゲーションアンカーPCRは、開裂生成物を検出するように適合され、選択されたサイトに設計されたリボザイムは、in vitroおよびin vivoの両方で特徴付けられた。 E6AP発現におけるリボザイム媒介減少は、マイトマイシンC誘発DNA損傷へのHeLa細胞のアポトーシス応答を向上させることが判明した。これらの知見は、その抑制が細胞傷害性薬剤で処理されたHPV陽性細胞のアポトーシスを増強することができるようE6APは、薬物標的としての可能性があることを示唆している。
プロテオミクスは、吸収の研究、分布、代謝、排泄、および毒性へのアプローチ
プロテオミクスのアプローチは、候補薬剤による治療後のマウスで変更されたレベルが表示された肝臓のタンパク質を同定するために使用された。候補薬剤または治療で処置したマウスの肝臓からのサンプルを調製し、定量化し、CyDye DIGEのフルールで標識し、二次元電気泳動に供した。つの異なる等電点電気泳動間隔からゲルのスキャンとイメージング（3-10、7-11、6.2から7.5）に続いて、自動化されたスポット処理は、処理の間に20％以上異なることが判明したものを含むゲルスポットの多数で行われたと未処理の状態。その後、差動調節タンパク質は、（b）はポストソース分解、化学的に支援フラグメンテーションを利用して、（）マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析ペプチドマス·フィンガープリンティングを用いた質量分析の3段階のアプローチを行ったおよび（c）液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析。このアプローチを用いて、我々はこれまでのところ、候補薬剤を持つマウスの治療後に121差動調節タンパク質を解決し、これらを使用して質量分析法の110を同定した。そのようなデータは潜在的に薬物と同様に治療後の潜在的な毒性に関与するタンパク質の代謝に改善された分子の洞察力を与えることができます。差動調節タンパク質は代謝研究の目標として、あるいは毒性のマーカーとして使用することができます。
DIGEシステムの開発：2次元蛍光ディファレンスゲル解析技術
2次元（2D）ゲル電気泳動は、プロテオームの比較的大きな部分の同時可視化を可能にする強力な手法です。しかし、変化し、既存の標識試薬の感度と定量的な能力の欠如を十分に文書化の問題、定量的なツールとして、この技術の使用が制限されている。二次元の違いはゲル電気泳動（2D DIGE）は、高精度な定量的な次元を追加することにより、この手法に基づいています。 2D DIGEと同じ2Dゲル上で分離する複数のタンパク質抽出物を有効にします。これはスペクトル解決、サイズ、CyDye DIGEのフルールとして知られているの電荷をマッチさせた蛍光色素を使用して、それぞれの抽出物を標識することにより実現されています。 2D DIGEは、実験ではすべての生物学的試料の等量を有する内部標準として知られているリファレンス·サンプルの使用を伴います。個々の生体試料を実験中の各ゲルに内部標準を含む、ゲル上の各タンパク質スポットの豊富さは、同じゲル上での内部標準現在の対応する場所に（すなわち、比率など）が相対的に測定できることを意味します。 Ettan DIGEは完全に2D DIGEによって提供される利点の恩恵を受けるように最適化された技術のシステムです。
レーザーマイクロダイセクションと飽和色素ラベリングして得られた試料を用いた比較プロテオーム解析
比較プロテオミクスの方法は急速に複雑な組織を含む多くの異なる生物学的システムに適用されています。これらのメソッドの落とし穴一つは、腫瘍学、神経科学などのいくつかのケースでは、組織の複雑さは、特定の細胞型の分離を必要とし、サンプルが限られていることです。レーザーマイクロダイセクション（LMD）は、一般的にプロテオミクス研究のためのそのような試料を得るために使用されています。我々は、テスト·システム、ヒトアミロイド前駆体タンパク質の遺伝子を運ぶトランスジェニック（Tg）ラットの単離されたCA1錐体ニューロン層のタンパク質の変化を識別するためのタンパク質サンプルと2-D DIGEの敏感なチオール反応性飽和色素標識でLMD組み合わせている。飽和色素標識は、100以上の蛋白質が大幅にP <0.0005で変更されることで、容易に5マグ総タンパク質から生成されている5,000以上のタンパク質のスポットマップを持つ非常に敏感であることが判明した。同定されたタンパク質のうち、すべてのトランスジーンの発現に関連付けられた一貫した変化を示した。ただし、500未満のマグの総タンパク質を含むゲルでPMFとMALDI-TOFを使用して大幅に異なるタンパク質を同定することは困難であった。制限試料の飽和色素標識の使用は、したがって、そのようなLMDなどのメソッドを用いて単離された大幅変更タンパク質を同定するための高感度MS技術の使用が必要になります。
プロテオミクス研究におけるタンパク質の検出方法
プロテオミクス研究の化学物質と同様に物理的な方法は、それらの分離に続いてタンパク質を検出するために使用されます。物理的な方法は、主にクロマトグラフィーの後に適用されます。彼らはどちらか特定の波長または質量分析法によるペプチド及びその断片の質量測定における光吸収のような分光法に基づいています。化学的方法は、二次元電気泳動した後に使用し、有機色素、金属キレート、蛍光染料、銀との複合、または蛍光物質であらかじめ標識で染色を採用しています。いくつかのケースではオートラジオグラフィーはまだ使用されています。これらのテクニックのすべてが感度の面で非常に異なっているので、定量的な測定のために、その有用性が大幅に異なります。このレビューは電気泳動ゲルに適用される様々なタンパク質の検出方法について説明します。
