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Articles by Ryosuke Yamada in JoVE
JoVE Clinical and Translational Medicine
新型抗癌药物使用手术标本肿瘤植的发展方法
1Department of Neurological Surgery, The Ohio State University Medical Center, 2Department of Pathology, The Ohio State University Medical Center
在这里，我们的脑肿瘤的手术切除标本，被称为“肿瘤块法”建立了药物疗效检测的一种方法。使用这种方法，我们可以评估药物的疗效没有打破实体肿瘤的微环境。为了验证这种方法的可靠性，我们描述了具有代表性的数据，与我们当前的第一线化疗药物替莫唑胺治疗脑胶质瘤标本。
Other articles by Ryosuke Yamada on PubMed
直立人-D-乳酸酸木糖发酵木糖同化基因导和重定向的戊糖磷酸途径中 L-乳酸脱氢酶基因缺陷植物乳杆菌 Phosphoketolase 通向通过改进的生产。
通过使用其 l-乳酸脱氢酶基因有缺陷和其 phosphoketolase 基因已被替换一个外源转酮酶基因植物乳杆菌 NCIMB 8826 乳酸菌取得了光学纯 d-乳酸通过木糖发酵生产。60 H 的发酵之后, 从 50 克/升的木糖制作了 d-乳酸 41.2 g/升。
从使用麦芽糖农用运输车和淀粉酶表示二倍体酵母的原料淀粉的反复的分批发酵。
我们成功地表明乙醇发酵与高乙醇生产力从原料淀粉重复十倍。我们建造 coexpressing 麦芽糖转运蛋白 AGT1，α-淀粉酶和糖化酶的二倍体酵母。AGT1 采用允许麦芽糖和麦芽三糖发酵以及淀粉酶活性的改进。我们还发现 α-淀粉酶活性发酵过程保留 10 mM 钙离子的增加最高的 α-淀粉酶活性反复发酵过程是 9.26 U/ml。最高的乙醇生产力是 2.22 g/l/h 在第四批，及后十个周期，超过 1.43 g/l 的乙醇生产力/h 保留的正如 α-淀粉酶活性在 6 43 U/ml。
从纤维素材料使用纤维素酶表达酵母的乙醇生产。
我们表现出从非晶纤维素利用纤维素酶 co 表示酵母直接乙醇发酵。Endoglucanases (EG) 和 cellobiohydrolases (CBH) 从里氏木霉和从黑曲霉 aculeatus beta glucosidases (BGL） 纳入了酵母菌株酿酒酵母 MT8-1 的基因组。BGL 显示在酵母细胞表面上和 EG 和 CBH 被分泌或细胞表面上显示。细胞表面或细胞分泌的活动形式，在成功地表示所有酶和纤维素降解增加 3-到 5 倍的工程菌 EG 和 CBH。从 10 g/L 磷酸肿了纤维素 (太平洋) 直接乙醇发酵也是使用 EG、 CBH 和 BGL co 表示酵母进行的。乙醇产量是 EG、 CBH 和 BGL 显示的酵母，这是比 EG 和 CBH 分泌酵母 (1.6 g/L 乙醇) 的高为 2.1 g/L。我们的研究结果表明表面显示单元格更适合直接乙醇发酵纤维素。
鸡尾酒三角一体化： 一种新的方法来构造纤维素酶表达比优化的酵母菌株。
丝状真菌 T.里氏木霉有效降解纤维素和生产各种纤维素酶 β-葡萄糖苷酶、 纤维素和水解等而闻名。同时，控制每个纤维素酶的表达水平，其比率和协同作用是重要的有效纤维素降解。然而，在酿酒酵母中很难同时控制许多不同的酶。若要构造与高效纤维素降解酵母，我们制定简单的方法来优化纤维素酶表达水平，命名的鸡尾酒三角一体化。
从纤维素材料在高温使用显示纤维素酶的耐高温酵母发酵 Marxianus 直接乙醇生产。
要利用纤维素生产燃料乙醇的材料，能够耐高温和同时糖化发酵的微生物已所需。然而，一个主要的缺点是糖化和发酵的最佳温度。大多数乙醇发酵的微生物有 28 度 C 到 37 摄氏度之间不等，虽然纤维素酶活性是最高在 50 摄氏度左右，显著降低温度下降的乙醇发酵最佳温度。因此，在本研究中，酵母发酵 marxianus，设有高增长和发酵温度升高，被用作从纤维素乙醇的生产国。株转基因细胞表面上看，它成功地将纤维素 β-葡聚糖转换为直接在 48 摄氏度与产量 4.24 g/l 的乙醇 10 g/l 12 小时内从显示里氏木霉纤维素和黑曲霉 aculeatus β-葡萄糖苷酶。（在克每克 β-葡聚糖消耗产生) 产量是乙醇的 0.47 g/g，相当于理论收益率 92.2%。这表明高温纤维素乙醇发酵可以高效地使用完成显示耐热纤维素酶在细胞表面上的重组 K.marxianus 应变。
基因拷贝数和酵母的产品形成多倍体。
酵母、 酿酒酵母等或发酵乳生产乙醇或一些有用的化合物生产的适当应变。纤维素酶表达酵母可以发酵酒精从纤维素材料 ；但是，生产力应增加更多。为了改善及工程师生产力，目标 gene(s) 被引入酵母基因组。一般来说，使用基因工程技术，增加综合的基因数目正在增加，如酶活性的蛋白质表达的能力也有增加。在此想方设法，我们重点对酶的活性和/或产品产量等生产力综合的基因拷贝数和多倍体的影响。
木糖异构酶基因的基因组整合和木糖醇的影响研究发酵木糖代谢酵母的建设。
木糖异构酶 (XI) 通路与酵母被构造的十一大过表达盒高融入 MT8 1 株酿酒酵母的基因组。由此产生的酵母菌株成功制造出两个木糖作为唯一碳源和混合的糖、 木糖和葡萄糖，未经任何适应程序组成的乙醇。乙醇从木糖和混合的糖发酵过程中收益率分别为 61.9%和 62.2%的理论碳经济的复苏。挖空的 GRE3，基因编码非特异性醛糖还原酶，主机的酵母菌株改善发酵配置文件。具体的乙醇生产率不仅木糖消耗率已有超过两倍的酵母木糖代谢改善使用 GRE3 活性酵母作为主机应变的十一大通路。此外，它证明该介质中的木糖醇窝藏基于十一的木糖代谢途径的酵母与展品对木糖的生产乙醇浓度依赖性抑制作用。从我们的研究结果，十一大通路整合和 GRE3 挖空的组合可能是统一的木糖同化途径中的结果和乙醇生产效率提高。
使用三角一体化和细胞融合，能有效地从原料淀粉乙醇酵母施工的新策略。
我们制定了新型战略构建酵母三角一体化和通过细胞融合多倍化相结合提高淀粉酶基因表达水平与酵母的实际潜力。链球菌牛黄 α-淀粉酶和根霉病菌糖化酶/阿尔法-凝集素融合蛋白基因被纳入单倍体酵母株。二倍体株由交配，建造这些单倍体株和四倍体株然后构造的细胞融合。四倍体株的 α-淀粉酶和糖化酶活动被增加到 1.5-和十倍，分别比与父母的压力。二倍体与四倍体株蔓延得更快、 产生了更多的细胞，和更有效比单倍体菌株发酵葡萄糖。从原料的淀粉乙醇生产力已有改善更多倍体 ；四倍体株消耗 150 g/l 的原淀粉和后 72 h 的发酵生产 70 g/l 的乙醇。集成到基因组和改进的实际潜力的酵母基因同时表达了我们战略构建酵母。
从使用工程的酿酒酵母的原料淀粉的有效而直接的谷胱甘肽生产。
谷胱甘肽是宝贵的三肽，广泛应用于制药、 食品和化妆品行业。谷胱甘肽是由使用酿酒酵母发酵工业生产。我们展示了酿酒酵母生产谷胱甘肽淀粉酶基因的表达使直接利用淀粉作为碳源，从而消除了克拉布特里影响所造成的过多的葡萄糖。因此，细胞生长和谷胱甘肽的生产效率得到极大改善。这种方法是可能适用于各种发酵过程的增值化学品在有氧条件下生产。
基于代谢组学的代谢途径工程赋予一重组酿酒酵母发酵木糖株醋酸和甲酸酸耐受。
新型酵母菌株对木质纤维素水解液中抑制剂的耐受性的发展是极有必要的生产生物乙醇。弱的有机酸如乙酸和甲酸酸预处理 （即溶和水解） 木质的不利影响微生物的生长和乙醇生产过程一定释放。然而，由于模式的毒性是复杂的基因工程战略解决弱的有机酸对酵母耐受性很少。因此，加强基础研究预计将查明改进薄弱酸宽容的靶基因。
直接使用 Co-displaying 两种淀粉酶、 两个多种纤维素酶和 β-葡萄糖苷酶表面工程酵母菌株的木薯纸浆生产乙醇。
为了发展生产燃料乙醇从木薯浆细胞表面工程 (炸) 技术，炸的酵母 co-displaying α-淀粉酶 (α-AM)，一种方法构造糖化酶、 纤维素、 cellobiohydrase、 β-葡萄糖苷酶酵母细胞的表面上。新型酵母菌株，拥有活动的所有酶，是能够产生直接从可溶性淀粉、 大麦 β-葡聚糖和酸治疗 Avicel 乙醇。木薯是在东南亚地区的主要农作物和主要用于淀粉生产。淀粉制造工艺中, 产生大量的固体废物，称为木薯浆。木薯纸浆的主要组件是淀粉 （约 60%） 和纤维素纤维 （大约 30%）。我们尝试同步糖化和木薯浆用此炸酵母的乙醇发酵。在发酵，酒精浓度淀粉与纤维素作为增加了下跌的木薯果肉中含有的纤维基质。结果清楚地表明炸的酵母是能够产生乙醇直接从木薯浆不增加任何水解酶。
从优化纤维素酶表达与使用二倍体株酿酒酵母的纤维素材料直接乙醇生产。
纤维素酶解需要纤维素酶纤维素、 水解和 β-葡萄糖苷酶的行动。表达式比率和这些酶的协同作用显著影响的程度和具体的纤维素降解率。在此研究中，我们使用我们以前开发的方法来优化纤维素酶表达水平的酵母，构造二倍体酿酒酵母株表达的纤维素酶，针对优化，并试图提高纤维素降解活性和启用从稻草，直接乙醇生产木质纤维素生物质最丰富的来源之一。
直接制取乙醇半纤维素材料的使用 Codisplaying 三种类型的木糖利用酿酒酵母细胞表面上的 Hemicellulolytic 酶工程的酵母菌株的稻草。
木质纤维素水解酶系总加工费用相对较高比例的乙醇生产从生物量帐户的糖化过程中使用的成本。细胞表面工程技术的融入细胞表面表达外源酶重组微生物菌种糖化和发酵过程提供了便利在这些费用的减少。我们构造不仅瑞氏木霉 codisplaying 糖酶、 β-糖苷从米曲霉和从黑曲霉 aculeatus β-葡萄糖苷酶水解半纤维素，而且，还同化木糖木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的表达通过从毕和木酮糖激酶从酿酒酵母的酿酒酵母。重组的应变成功地生产乙醇从稻草水解液含有木聚糖、 低聚木糖和纤维低聚糖，而无需添加糖水解酶或解毒的半纤维素材料组成。乙醇滴度应变是经过 72 h 发酵，这是大约比控制应变的引诱高 8.2 g/l。(克每克消耗的稻草水解液中的总糖乙醇) 产量是 0.41 g/g，符合为理论产量的 82%。因此，细胞表面工程应变是高度有效的巩固半纤维素材料生产乙醇的过程。
从使用表达淀粉酶的酿酒酵母株水稻高产的直接和高效的乙醇生产。
高效乙醇酵母啤酒酵母不能直接产生乙醇从原料的淀粉。因此，传统的乙醇生产需要昂贵和复杂的过程。这项研究，我们制订了从高产水稻收获在日本使用表示没有任何预处理或添加酶或养分酵母的淀粉酶的直接和高效的乙醇生产过程。从高产糙米 (1.1 g/L/h) 乙醇生产力是约五折高比从纯净原料玉米淀粉 (0.2 g/L/h) 时获得养分被添加。使用相当于 10%的发酵卷没有任何营养补充剂的接种量导致乙醇生产效率和产量达到 1.2 g/L/h 和 101%，分别在 24 h 内。水稻高产证明这是适合生物乙醇的生产原料。此外，我们多倍体的淀粉酶表示酵母是足够强劲，以生产高效地从真正的生物质乙醇。这是使用没有任何预处理或商业酶加淀粉酶表示酵母菌株实生物质直接乙醇生产的第一次报告。
