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Articles by Sabine Metzger in JoVE
JoVE General
Rapide et sensible colloïdal Coomassie G-250 de coloration des protéines dans des gels de polyacrylamide
Biological Medical Research Center (BMFZ), University Duesseldorf
Cette vidéo est de populariser une colloïdale Coomassie G-250 protocole de coloration en fonction de Kang
Other articles by Sabine Metzger on PubMed
De La Phosphorylation in Vitro De Insulin Receptor Substrate 1 Par La Protéine Kinase C-zeta: Analyse Fonctionnelle Et Identification De Nouveaux Sites De Phosphorylation
La protéine kinase C-zeta (PKC-zeta) participe à la fois dans la signalisation insulinique en aval et dans le contrôle de rétroaction négative de l'action d'insuline. Ici nous avons utilisé une approche in vitro pour identifier les sites de phosphorylation PKC-zeta dans insulin receptor substrate 1 (IRS-1) et de caractériser les implications fonctionnelles. Un recombinante IRS-1 fragment (RIR-1 (449) (-) (664)) contenant majeurs motifs tyrosine pour l'interaction avec le phosphatidylinositol (PI) 3-kinase fortement associé à la sous-unité de p85alpha PI 3-kinase après phosphorylation Tyr par le récepteur de l'insuline. La phosphorylation des RIR-1 (449) (-) (664) par la PKC-zeta induit une inhibition importante de ce processus avec un mélange de classiques isoformes de la PKC étant moins efficace. La PKC-zêta et les isoformes classiques phosphorylée RIR-1 (449) (-) (664) sur Ser (612). Cependant, la modification de ce résidu ne pas réduire l'affinité de liaison à p85alpha pTyr-peptides contenant (acides aminés 605-615 de rat IRS-1), tel que déterminé par résonance plasmonique de surface. RIR-1 (449) (-) (664) est ensuite phosphorylée par la PKC-zêta utilisant [(32) P] ATP et soumis à la cartographie sur la base de phosphopeptide trypsique bidimensionnelle CLHP couplée à la spectrométrie de masse. Ser (498) et Ser (570) ont été identifiés comme sites phosphosérine nouveaux ciblés par la PKC-zeta. Les deux sites ont en outre été confirmé par la cartographie phosphopeptide de la Ser correspondant -> mutants Ala des RIR-1 (449) (-) (664). Ser (570) a été spécifiquement ciblés par la PKC-zeta, comme le montre par immunoblotting avec un antisérum contre phosphospécifique Ser (570) d'IRS-1. Lier de p85alpha au mutant S570A est moins sensible à l'inhibition par la PKC-zêta, par rapport au mutant S612A. En conclusion, nos données in vitro montrent une forte action inhibitrice de la PKC-zeta au niveau de IRS-1/PI 3-kinase impliquant l'interaction de multiples sites de phosphorylation de sérine. Considérant Ser (612) semble ne pas participer à la commande de signalisation de l'insuline négative, Ser (570) peut au moins en partie contribuer à ce processus.
Le Manque De Myoglobine Provoque Un Commutateur Dans Le Choix Du Substrat Cardiaque
La myoglobine est un important hémoprotéine O2 intracellulaire obligatoire dans le cœur et le muscle squelettique. Étonnamment, la perturbation de la myoglobine chez la souris (myo-/ -) ont abouti à aucun phénotype évident et une fonction cardiaque normale a été suggéré d'être médiatisée par des modifications structurelles qui ont tendance à aggraver l'écart de pression d'oxygène à partir capillaire vers les mitochondries. Ici, nous signalent que le manque de la myoglobine provoque un décalage dans l'utilisation des substrats biochimiques cardiaques à partir d'acide gras à l'oxydation du glucose. Protéome et analyse de l'expression du gène découvert des enzymes clés de la bêta-oxydation mitochondriale ainsi que le récepteur nucléaire PPAR être négative dans la myoglobine déficientes cœurs. Utilisation de la TEP-FDG nous a montré une augmentation substantielle de l'absorption in vivo cardiaque de glucose dans le myo-/ - souris (6,7 + / -2,3 versus 0,8 + / -0,5% de la dose injectée à l'état sauvage-type, n = 5, P <0,001) , qui a été associée à une régulation à la hausse de l'transporteur de glucose GLUT4. Le commutateur métabolique a été confirmée par des études RMN 13C isotopomère spetroscopic de coeurs isolés qui ont révélé que [1,6-13C2] l'utilisation du glucose a été augmenté dans le myo-/ - coeurs (38 + / -8% par rapport à 22 + / -5% à l'état sauvage -type, n = 6, P <0,05), et concomitamment, [U-13C16] palmitate d'utilisation a été diminué dans le groupe myoglobine-déficiente (42 + / -6% contre 63 + / -11% de type sauvage, n = 6, P <0,05). En raison de l'effet O2-économe de l'utilisation du glucose, le décalage observé dans le métabolisme substrat avantages homéostasie énergétique et par conséquent représente un processus d'adaptation moléculaire permettant de compenser le manque de la myoglobine transporteur d'oxygène dans le cytosol. En outre, nos données suggèrent que la myoglobine un niveau altéré lui-même peut être un facteur déterminant pour le choix du substrat dans le cœur. Le texte intégral de cet article est disponible en ligne à http://circres.ahajournals.org.
Lipopolysaccharide Induite Par Nitration De La Tyrosine Et L'inactivation De La Glutamine Synthétase Hépatique Chez Le Rat
La glutamine synthétase (GS) dans le foie est limitée à une population d'hépatocytes périveineuse petite et joue un rôle important dans le piégeage de l'ammoniac qui a échappé à la périportale urée-synthèse compartiment. Nous avons examiné l'effet d'une injection intrapéritonéale unique de lipopolysaccharide (LPS) in vivo sur la synthèse de la glutamine dans le foie de rat. LPS induit l'expression d'injection d'oxyde nitrique synthase inductible, qui a été maximale après 6 à 12 heures mais il est revenu vers des niveaux de contrôle dans les 24 heures. Vingt-quatre heures après l'injection de LPS, une d'environ cinq fois plus de tyrosine-nitrés protéines dans le foie a été trouvé, et l'expression des protéines GS a été diminué d'environ 20%, tandis que l'activité GS a été abaissé de 40% à 50%. GS a été jugée la tyrosine-nitrés en réponse au LPS, et immunodéplétion de la tyrosine-nitrés protéines a diminué protéine GS d'environ 50%, mais n'a eu aucun effet sur l'activité GS. Avec la constatation par spectrométrie de masse que le peroxynitrite induit l'inactivation de protéine purifiée de GS est associé à la nitration du résidu tyrosine du site actif, nos données suggèrent que la nitration tyrosine contribue critique à l'inactivation de l'enzyme. En ligne avec l'inactivation GS, synthèse de la glutamine à partir d'ammoniac (0,3 mmol / L) dans les foies perfusés de rats de 24 heures LPS-traitées a diminué d'environ 50%, tandis que la synthèse d'urée n'a pas été significativement affectés. En conclusion, LPS altère désintoxication hépatique d'ammoniac à la fois par la régulation négative de GS et de son inactivation en raison de la nitration tyrosine. Le défaut résultant de la fonction cellulaire au trésor périveineuse en ce qui concerne l'élimination d'ammoniac peuvent contribuer à une septicémie provoquée par le développement d'une hyperammoniémie chez les patients qui ont une cirrhose.
Le Polysaccharide De La PrP 27-30 échafaudage Est Un Composé Commun Des Prions Naturelles Et Se Compose D'Alpha-linked Polyglucose
Un polysaccharide inerte échafaudage identifiée comme une composante de 5-15% de tiges prion (PrP 27-30) est sans ambiguïté à distinguer des groupes N-glycosyl et de l'ancre GPI de la PrP, et se compose principalement de 1,4-glucose liée avec une certaine ramification par l'intermédiaire d'1,4,6-lié au glucose. Nous montrons que cet échafaudage polysaccharide est un composant commun secondaire des prions présents dans hamster pleine longueur PrP (Sc), des tiges à prions et prions SCN2A souris à partir de culture cellulaire. La préparation de tiges à prions est améliorée, résultant en un polysaccharide échafaudage libre de l'infectiosité restante. En outre, nous avons déterminé la stéréochimie des liens glycosidiques comme pré-dominante si elle n'est pas entièrement alpha-glycosidique. L'origine du polysaccharide, son interaction avec la PrP et sa relation avec le potentiel de glycogène et de corps amylacés sont discutés.
L'oxygène Singulet Inactive Protéine Tyrosine Phosphatase-1B Par Oxydation De La Cystéine Du Site Actif
L'oxygène singulet ((1) O (2)), une forme électronique excité de l'oxygène moléculaire, est un médiateur des effets biologiques des rayonnements ultraviolets A, en stimulant des cascades de signalisation dans les cellules humaines. Nous démontrons ici que (1) O (2) généré par photosensibilisation ou par thermodécomposition de 3,3 '- (1,4-naphtylidène) dipropionate-1 ,4-endoperoxyde inactive protéines phosphatases isolées tyrosine PTPases). Activités PTPase de PTP1B ou CD45 ont été supprimées par de faibles concentrations de (1) O (2), mais ont été en grande partie restaurée par un post-traitement avec le dithiothréitol. Ionisation de spectrométrie de masse par électropulvérisation analyse de digestion trypsique de PTP1B exposé à (1) O (2) a révélé l'oxydation du site actif de Cys215 que le résidu de cystéine ne oxydé. En résumé, (1) O (2) peut activer des cascades de signalisation en interférant avec la déphosphorylation phosphotyrosine.
Suivi Changements Conformationnels Pendant Le Cycle Catalytique De OpuAA, La Sous-unité ATPase De La Opua Transporteur ABC De Bacillus Subtilis
Le transporteur ABC (ATP-binding cassette transporteur) Opua est l'un des cinq systèmes de transport membranaire chez Bacillus subtilis qui interviennent dans osmoprotection par l'importation de solutés compatibles. Tout comme les transporteurs ABC bactériennes et archaea qui catalysent l'importation de substrats, Opua (où Opu est absorption osmoprotectant) est composé d'une sous-unité ATPase (OpuAA), une sous-unité transmembranaire (OpuAB) et une extracellulaire substrat protéine de liaison (OpuAC). En contraste avec de nombreux bien connue ABC-ATPases, OpuAA est composé non seulement d'un catalyseur et un domaine hélicoïdal, mais aussi d'un domaine accessoire situé à son extrémité C-terminale. Le paradigme d'une telle architecture est MalK, l'ABC-ATPase de l'importateur du maltose d'Escherichia coli, pour lesquels des informations détaillées structurelle et fonctionnelle est disponible. Dans la présente étude, nous avons appliqué la solution FRET (transfert d'énergie par résonance Förster) en utilisant des techniques simples deux mutants cystéine pour obtenir une première information structurelle sur l'architecture du dimère OpuAA en solution. L'analyse de nos résultats en détail et en les comparant avec les structures existantes MalK a révélé que les domaines catalytiques et hélicoïdale a adopté une disposition semblable à celles de MalK, alors que de profondes différences dans l'orientation tridimensionnelle du domaine accessoire, qui contient deux CBS (cystathionine bêta -synthétase) domaines, ont été observés. Ces résultats apportent un nouvel éclairage sur le rôle de ce présent de domaine accessoire dans un certain sous-ensemble de l'ABC-ATPase dans le peaufinage de la structure tridimensionnelle et la fonction biologique.
Analyse Génétique Et Biochimique De La Sérine / Thréonine Protéines Kinases PknA, PknB, PknG Et PknL De Corynebacterium Glutamicum: Preuve De La Non-essentialité Et De La Phosphorylation De OdhI Et FtsZ Par Des Kinases Multiples
Nous avons montré précédemment que le 2-oxoglutarate déshydrogénase inhibiteur de la protéine OdhI de Corynebacterium glutamicum est phosphorylée par PknG à Thr14, mais que la serine aussi plus / thréonine kinases (STPKs) peut phosphoryler OdhI. Pour les identifier, un ensemble unique de trois (DeltapknA, DeltapknB, DeltapknL), cinq doubles (DeltapknAG, DeltapknAL, DeltapknBG, DeltapknBL, DeltapknLG) et deux mutants de délétion triples (DeltapknALG, DeltapknBLG) ont été construits. L'existence de ces mutants montre que PknA, PknB, PknG et PknL ne sont pas essentielles chez C. glutamicum. L'analyse de l'état de phosphorylation OdhI dans les souches mutantes a révélé que tous les quatre STPKs peut contribuer à la phosphorylation OdhI, avec PknG étant le plus important. Seuls les mutants dans lequel a été supprimé pknG ont montré une inhibition de la croissance forte sur les plaques d'agar contenant la glutamine comme source de carbone et d'azote. Thr14 et Thr15 de OdhI se sont révélées être phosphorylée in vivo, soit individuellement, soit simultanément, et la preuve pour un maximum de deux sites de phosphorylation supplémentaires ont été obtenues. La déphosphorylation de OdhI a été montré pour être catalysée par la protéine phosphatase phospho-Ser/Thr Ppp. Outre OdhI, le FtsZ protéines de division cellulaire a été identifié en tant que substrat de PknA, PknB et PknL et du Ppp phosphatase, suggérant un rôle de ces protéines dans la division cellulaire.
Caractérisation De La O-phosphohydroxyproline Dans Rat {alpha}-crystalline Une
Modifications post-traductionnelles ont une importance majeure pour la structure et la fonction d'une multiplicité de protéines. La phosphorylation est un phénomène largement répandu parmi les protéines eucaryotes. Alors que O-phosphorylation sur les chaînes latérales de la sérine, la thréonine, et la tyrosine dans les protéines est bien connue et a été largement étudié, à notre connaissance la phosphorylation endogène de l'hydroxyproline n'a pas été signalée auparavant. Dans le présent travail, nous fournissons des preuves pour la première fois que l'O-phosphohydroxyproline (Hyp (P)) est un acide aminé protéinogénique. À détecter Hyp (P) dans les protéines on produit un Hyp (P) spécifique anticorps polyclonal. Nous avons pu identifier Hyp (P) dans diverses protéines par Western blot, et nous avons caractérisé la position de la séquence de Hyp (P) dans la protéine α-crystalline Une spectrométrie de masse à ionisation par électrospray en tandem. Nos expériences démontrent clairement l'hydroxylation et la phosphorylation subséquente d'un résidu de proline dans α-crystalline A l'œil, ainsi que dans le tissu cardiaque de rat.
Purification Facile Et Rapide De La Nisine Hautement Actif
La nisine est un peptide antimicrobien produite et sécrétée par plusieurs souches de L. lactis et est spécifiquement actif contre les bactéries Gram-positives. Dans des études antérieures, la nisine a été purifié par chromatographie d'échange cationique à pH faible employant une élution en une seule étape en utilisant 1 M de NaCl. Ici, nous décrivons un protocole de purification optimisé en utilisant une élution en cinq étapes de NaCl pour éliminer les contaminants. La nisine obtenu est exempt d'impuretés et montre une forte activité bactéricide contre la souche sensible nisine de L. lactis NZ9000. Purifiée nisine présente une CI (50) de ~ 3 nM, qui est une amélioration dix fois par rapport à la nisine obtenu par l'intermédiaire du procédé en une étape d'élution.
Identification Des Fibroblast Growth Factor 1 (FGF-1) Dans Un Produit Du Marché Noir
L'utilisation de facteurs de croissance pour accélérer la guérison des blessures sportives est limitée aux termes de la World Anti-Doping Agency (AMA) code antidopage. Cheating athlètes ont utilisé le marché noir comme une source de substances améliorant la performance. Les médicaments qui actuellement subissent les essais cliniques sont souvent offerts - en dépit des risques inconnus pour la santé associés à l'administration des produits pharmaceutiques non approuvés. Récemment, un facteur de croissance nouvelle (appelée facteur de croissance des fibroblastes 1/FGF-1) avec des effets connus sur la réparation et la régénération des tissus endommagés a été détecté dans un produit du marché noir non marqué confisqués par les douanes allemandes. L'identification de la protéine a été réalisée par électrophorèse sur gel à une et deux dimensions de polyacrylamide (SDS-PAGE et 2D-PAGE), différentes digestions protéolytiques, des méthodes immunologiques et nano-liquide high-resolution/high-accuracy chromatographie de masse Orbitrap spectrométrie. L'analyse par SDS-PAGE révélé de légères différences concernant le poids moléculaire du recombinante humaine marché et noir FGF-1. Utilisation dans un gel protéolyse, une troncature ou la modification situé à l'extrémité N-terminale de la protéine a été proposé. Ces résultats démontrent que les candidats médicaments sans l'approbation clinique peut être facilement obtenu à partir du marché noir, quelle que soit les conséquences potentiellement dangereuses pour le consommateur, ce qui corrobore la nécessité de démarches proactives et préventives de contrôle du dopage. À cet égard, des concentrations physiologiques de spécimens sang et d'urine recueillis auprès de sujets sains ont été analysés et ont été trouvés à aller en dessous de 28 pg / ml dans les urines, alors qu'il n'y avait pas détectable FGF-1 dans le plasma.
