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Articles by Sabine Metzger in JoVE
JoVE General
Veloce e sensibile colloidale Coomassie G-250 colorazione per le proteine in gel di poliacrilammide
Biological Medical Research Center (BMFZ), University Duesseldorf
Questo video è diffondere una colloidale Coomassie G-250 protocollo di colorazione a seconda Kang
Other articles by Sabine Metzger on PubMed
In Vitro Fosforilazione Del Substrato Del Recettore Di Insulina 1 Di Chinasi Di Proteina C-zeta: Analisi Funzionale E L'identificazione Dei Siti Di Fosforilazione Romanzo
Chinasi di proteina C-zeta (PKC-zeta) partecipa in segnalazione a valle insulina e nel controllo di feedback negativo di azione di insulina. Qui abbiamo utilizzato un approccio in vitro per identificare i siti di fosforilazione della PKC zeta all'interno del substrato di insulina recettore 1 (IRS-1) e per caratterizzare le implicazioni funzionali. Frammento di un IRS-1 ricombinante (rIRS-1(449)(-)(664)) contenenti motivi di tirosina principali per l'interazione con il fosfatidilinositolo (PI) 3-chinasi fortemente associata per la subunità p85alpha di PI 3-chinasi dopo fosforilazione Tyr dal recettore insulina. La fosforilazione della rIRS-1(449)(-)(664) di PKC zeta indotta da una prominente inibizione di questo processo con una miscela di classico isoforme PKC, essendo meno efficace. PKC zeta sia la classica isoforme fosforilate rIRS-1(449)(-)(664) su Ser(612). Tuttavia, la modifica di questo residuo non riduce l'affinità di p85alpha associazione a pTyr contenenti peptidi (aminoacidi 605-615 del ratto IRS-1), come determinato dalla risonanza plasmonica di superficie. rIRS-1(449)(-)(664) fu poi fosforilato da PKC zeta utilizzando [(32) P] ATP e sottoposti a triptico fosfopeptide mapping basato su HPLC bidimensionale accoppiata alla spettrometria di massa. Ser(498) e Ser(570) sono stati identificati come romanzo phosphoserine siti presi di mira da PKC zeta. Entrambi i siti sono stati inoltre confermati da fosfopeptide mappatura del corrispondente Ser--> mutanti Ala di rIRS-1(449)(-)(664). Ser(570) è stato specificamente mirato di PKC-zeta, come mostrato da immunoblotting con un antisiero phosphospecific contro Ser(570) di IRS-1. Associazione di p85alpha per la S570A mutante è stato meno sensibili all'inibizione di PKC-zeta, se confrontato con il mutante S612A. In conclusione, i nostri dati in vitro dimostrano una forte azione inibente della PKC-zeta presso il livello di IRS-1/PI 3-chinasi interazione che coinvolgono più siti di fosforilazione della serina. Considerando che la Ser(612) non sembra partecipare il controllo negativo dell'insulina di segnalazione, Ser(570) almeno in parte possono contribuire a questo processo.
Mancanza Di Mioglobina Provoca Un Interruttore Selezione Substrato Cardiaco
Mioglobina è un'emoproteina di associazione O2 intracellulare importante nel cuore e muscolo scheletrico. Sorprendentemente, la perturbazione della mioglobina nei topi (myo-/-) ha provocato nessun fenotipo ovvio e normale funzione cardiaca è stato suggerito per essere mediato da alterazioni strutturali che tendono a steep il gradiente di pressione di ossigeno dal capillare ai mitocondri. Qui riportiamo che mancanza di mioglobina provoca uno spostamento biochimico nell'utilizzazione del substrato cardiaco da acidi grassi per ossidazione del glucosio. Analisi di espressione genica e proteoma scoperti enzimi chiave di metaboliti mitocondriali, come pure i recettori nucleari PPAR essere downregolata nei cuori di mioglobina-carenti. Utilizzando la FDG-PET abbiamo mostrato un sostanzialmente aumentato assorbimento cardiaco in vivo del glucosio in myo-/-mice (6,7 + 2.3 versus 0.8+/-0.5% della dose iniettata nel wild-type, n = 5, P < 0.001), che è stato associato con un upregulation del trasportatore di glucosio GLUT4. L'interruttore metabolico fu confermata da 13 C NMR spetroscopic isotopomer studi di cuori isolati che ha rivelato che [1,6-13 C 2] è stata aumentata utilizzazione del glucosio in myo/cuori (38 + /-8% versus 22 + /-5% nel wild-type, n = 6, P < 0.05) e simultaneamente, [U-13 C 16] utilizzazione palmitato era diminuito nel gruppo carente di mioglobina (42 + /-6% contro il 63 ± 11% nel wild-type, n = 6, P < 0.05). A causa dell'effetto O2-risparmiatori di utilizzazione del glucosio, il cambiamento osservato nel metabolismo di substrato benefici dell'omeostasi energetica e rappresenta quindi un adattamento molecolare processo che permette di compensare la mancanza della mioglobina vettore di ossigeno citosolico. Inoltre, i nostri dati suggeriscono che un livello di mioglobina alterati si può essere un critico determinante per la scelta del substrato nel cuore. Il testo integrale di questo articolo è disponibile online presso http://circres.ahajournals.org.
Nitrazione Tirosina Indotta Dal Lipopolisaccaride E Inattivazione Della Sintetasi Glutamina Epatica Nel Ratto
Sintetasi glutamina (GS) nel fegato sono limitato ad una popolazione di piccole perivenous degli epatociti e svolge un ruolo importante nello scavenging di ammoniaca che è sfuggito il vano periportal sintesi di urea. Abbiamo esaminato l'effetto di una singola iniezione intraperitoneale di lipopolisaccaride (LPS) in vivo sulla sintesi della glutammina nel fegato di ratto. Iniezione di LPS induce espressione inducibile ossido nitrico sintasi, che è massima dopo 6-12 ore ma ritorna verso livelli di controllo entro 24 ore. Ventiquattro ore dopo l'iniezione di LPS, un aumento di cinque volte circa in tirosina-nitrurato proteine nel fegato è stato trovato, e l'espressione della proteina GS era diminuita di circa il 20%, considerando che l'attività della GS è stato abbassato dal 40% al 50%. GS è stato trovato per essere nitrurato tirosina in risposta a LPS, e immunodepletion delle proteine tirosin-nitrurato diminuita della proteina GS da circa il 50%, ma ha avuto alcun effetto sulle attività della GS. Insieme con la ricerca tramite spettrometria di massa che indotta da perossinitrito inattivazione della GS purificato è associato con nitrazione di residui di tirosina del sito attivo, i nostri dati suggeriscono che nitrazione tirosina criticamente contribuisce all'inattivazione dell'enzima. In linea con l'inattivazione di GS, sintesi di glutamina da ammoniaca (0,3 mmol/L) in fegati perfusi da ratti trattati con LPS 24 ore su 24 sono diminuita del 50% circa, considerando che la sintesi di urea non è stata influenzata in modo significativo. In conclusione, LPS altera la disintossicazione epatica ammoniaca da downregulation del GS e sua inattivazione a causa di nitrazione di tirosina. Il difetto risultante della funzione delle cellule di perivenous al tesoro per quanto riguarda l'eliminazione di ammoniaca può contribuire allo sviluppo di sepsi-indotta di iperammoniemia in pazienti con cirrosi.
Patibolo Polisaccaride Di PrP 27-30 è Un Comune Composto Di Prioni Naturali E Consiste Di Polyglucose Legata All'alfa
Un'impalcatura di polisaccaride inerte identificato come componente di 5-15% delle barre di prioni (PrP 27-30) è inequivocabilmente distinguibile dai gruppi N-glicosil e il àncora GPI di PrP e consiste principalmente di glucosio legata all'1,4 con qualche ramificazione via glucosio legate 1,4,6. Dimostriamo che questa impalcatura polisaccaride è un comune componente secondaria di prioni trovato nel criceto full-length PrP(Sc), canne da prioni e nei prioni mouse ScN2a da coltura cellulare. La preparazione da canne da prioni è stata migliorata, risultante in un ponteggio polisaccaride libero di infettività rimanenti. Inoltre, abbiamo determinato la stereochimica dei legami glicoside come iGuzzini, se non interamente alfa-glicosidico. L'origine del polisaccaride, la sua interazione con PrP e la sua relazione potenziale di glicogeno e corpora amylacea sono discussi.
Ossigeno Singoletto Inattiva Proteina Tirosina Fosfatasi-1B Di Ossidazione Della Cisteina Del Sito Attivo
Ossigeno singoletto ((1)O(2)), una forma di ossigeno molecolare, elettronicamente eccitata è un mediatore degli effetti biologici dei raggi ultravioletti una radiazione, stimolando la segnalazione cascate nelle cellule umane. Qui dimostriamo che (1)O(2) generati da fotosensibilizzazione o da thermodecomposition di 3, 3'-(1,4-naphthylidene) dipropionate-1,4-endoperoxide inattiva isolato della proteina tirosina fosfatasi (PTPases). Attività di PTPase di PTP1B o CD45 furono abolite da basse concentrazioni di (1)O(2), ma furono in gran parte restaurato di post-trattamento con ditiotreitolo. Analisi di spettrometria di massa ionizzazione elettrospray del Digesto triptico della PTP1B esposta a (1)O(2) rivelato ossidazione del sito attivo Cys215 come i residui di cisteina solo ossidato. In sintesi, (1)O(2) può attivare cascades segnalazione interferendo con phosphotyrosine defosforilazione.
Cambiamenti Conformazionali Di Controllo Durante Il Ciclo Catalitico Di OpuAA, La Subunità ATPasi Del Trasportatore ABC OpuA Da Bacillus Subtilis
Il trasportatore di ABC (trasportatore ATP-binding-cassette) OpuA è uno dei cinque sistemi di trasporto di membrana in Bacillus subtilis che mediano osmoprotection importando soluti compatibili. Proprio come tutti i batteri e archaeal ABC trasportatori che catalizzano l'importazione dei substrati, OpuA (dove Opu è osmoprotectant assorbimento) è composto da una subunità ATPasi (OpuAA), una subunità transmembrana (OpuAB) e una proteina extracellulare substrato-associazione (OpuAC). In contrasto con molti ben noti ABC-ATPasi, OpuAA è composta non solo di un catalizzatore e un dominio elicoidale, ma anche di un dominio accessorio che si trova presso il C-terminus. Il paradigma di tale architettura è Modolo, ABC-ATPasi dell'importatore maltosio di Escherichia coli, per cui sono disponibili informazioni strutturali e funzionali. Nel presente studio, abbiamo applicato utilizzando due mutanti singolo cisteina per ottenere informazioni strutturali iniziale sull'architettura del dimero OpuAA in soluzione tecniche di soluzione FRET (trasferimento di energia per risonanza). Analizzando i risultati in dettaglio e confrontandoli con il Modolo esistente strutture ha rivelato che i domini catalitici ed elicoidali ha adottato una disposizione simile a quelli di Modolo, considerando le profonde differenze nell'orientamento tridimensionale del dominio accessorio, che contiene due domini CBS (cistationina beta-sintetasi), sono state osservate. Questi risultati gettano nuova luce sul ruolo di questo dominio accessorio presente in un certo sottoinsieme di ABC-ATPasi nella messa a punto della struttura tridimensionale e la funzione biologica.
Analisi Genetica E Biochimica Di Serina/treonina Proteina Chinasi PknA, PknB, PknG E PknL Di Corynebacterium Glutamicum: Prova Per Non-essenzialità E Per La Fosforilazione Di OdhI E FtsZ Da Chinasi Multiple
Abbiamo precedentemente dimostrato che il 2-ossoglutarato deidrogenasi inibitore della proteina OdhI di Corynebacterium glutamicum è fosforilata da PknG a Thr14, ma che anche altre serina/treonina chinasi di proteina (STPKs) possono fosforilare OdhI. Per identificare questi, un set di tre single (DeltapknA, DeltapknB, DeltapknL), sono stati costruiti cinque doppie (DeltapknAG, DeltapknAL, DeltapknBG, DeltapknBL, DeltapknLG) e due mutanti di delezione triplo (DeltapknALG, DeltapknBLG). L'esistenza di questi mutanti dimostra che non sono essenziali in c. glutamicum PknA, PknB, PknG e PknL. Analisi dello stato di fosforilazione OdhI in ceppi mutanti ha rivelato che tutti i quattro STPKs può contribuire a OdhI fosforilazione, con PknG essendo quella più importante. Solo mutanti in cui è stato eliminato pknG ha mostrato un'inibizione della crescita forte su piastre di agar contenente la glutammina come fonte di carbonio e azoto. Thr14 e Thr15 di OdhI sono stati indicati per essere fosforilato in vivo, singolarmente o contemporaneamente, e prova per fino a due siti di fosforilazione supplementare è stato ottenuto. Defosforilazione di OdhI è stato indicato per essere catalizzato dalla fosfatasi fosfo-Ser/Thr proteine Ppp. Oltre a OdhI, la divisione cellulare della proteina FtsZ è stata identificata come substrato di PknA, PknB e PknL e di fosfatasi Ppp, suggerendo un ruolo di queste proteine nella divisione cellulare.
Caratterizzazione Di O-phosphohydroxyproline Nel Ratto {alpha}-crystallin A
Traslazionali hanno grande importanza per la struttura e la funzione di una molteplicità di proteine. La fosforilazione è un fenomeno molto diffuso tra le proteine eucariotiche. Considerando che O-fosforilazione sulle catene laterali di Serina, treonina e tirosina di proteine è ben nota ed è stata studiata approfonditamente, a nostra conoscenza la fosforilazione endogena di idrossiprolina non è precedentemente stata segnalata. Nel presente lavoro, forniamo prove per la prima volta che O-phosphohydroxyproline (Hyp(P)) è un amminoacido proteinogenici. Per rilevare le Hyp(P) in proteine abbiamo generato un Hyp (P)-anticorpo policlonale specifico. Noi potremmo identificare Hyp(P) in varie proteine mediante analisi Western blot, e ci caratterizza la posizione di sequenza di Hyp(P) nella proteina α-crystallin A spettrometria di massa tandem ionizzazione elettrospray. Nostri esperimenti dimostrano chiaramente idrossilazione e successiva fosforilazione di un residuo di prolina nella α-crystallin A negli occhi, così come nel tessuto cardiaco di ratto.
Facile E Rapida Purificazione Della Nisina Altamente Attiva
La nisina è un peptide antimicrobico prodotto e secreto da diversi ceppi di L. lactis e specificatamente attivo contro i batteri Gram-positivi. In studi precedenti, la nisina è stata purificata mediante cromatografia a scambio cationico a basso pH impiegando un unico passaggio eluizione utilizzando 1 M NaCl. Qui, descriviamo un protocollo di purificazione ottimizzata utilizzando un'eluizione di NaCl cinque fasi per rimuovere i contaminanti. il nisina ottenuta è privo di impurità e mostra un'elevata attività battericida contro il ceppo sensibile nisina L. lactis NZ9000. Purificato nisina esibisce un IC(50) di ~ 3 nM, che è un miglioramento decuplicato rispetto a nisina ottenuto mediante il procedimento di eluizione One-Step.
Identificazione Del Fattore Di Crescita Dei Fibroblasti 1 (FGF-1) in Un Prodotto Di Mercato Nero
L'uso di fattori di crescita accelerata guarigione delle lesioni sportive è limitato a norma del codice mondiale Anti-Doping Agency (WADA) anti-doping. Barare atleti hanno usato il mercato nero come fonte di sostanze dopanti. Farmaci che attualmente sottoposti a studi clinici sono spesso offerti - nonostante lo sconosciuto salute rischi associati con la somministrazione di farmaci non approvati. Recentemente, un nuovo fattore di crescita (denominato come fattore di sviluppo del fibroblasto FGF-1/1) con effetti noti sulla riparazione e rigenerazione dei tessuti danneggiati è stato rilevato in un prodotto senza etichetta nero mercato confiscato dalla dogana tedesca. L'identificazione della proteina è stato realizzato da one e two - dimensional gel di poliacrilammide elettroforesi (SDS-PAGE e 2D-PAGE), digestioni proteolitici differenti, metodi immunologici e nano-liquido cromatografia ad alta risoluzione e alta accuratezza Orbitrap spettrometria totale. L'analisi SDS-PAGE ha rivelato lievi differenze riguardanti il peso molecolare di ricombinante umano e mercato nero FGF-1. Tramite proteolisi in gel, è stato suggerito un troncamento o modifica situato presso il N-terminale della proteina. Questi risultati dimostrano che candidati farmaci senza approvazione clinica possono essere facilmente ottenuti dal mercato nero, indipendentemente dalle possibili conseguenze pericolose per il consumatore, che corrobora la convinzione della necessità di proattivo e preventivo controllo approcci il doping. A tale proposito, fisiologiche concentrazioni di campioni di sangue e delle urine raccolti da individui sani sono stati analizzati e sono stati trovati a gamma sotto 28 pg/ml nelle urine, mentre non ci fu nessun rilevabile FGF-1 nel plasma.
