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Articles by Sabine Metzger in JoVE
JoVE General
Rápido y sensible coloidal Coomassie G-250 La tinción de proteínas en geles de poliacrilamida
Biological Medical Research Center (BMFZ), University Duesseldorf
Este vídeo se popularizar un Coomassie coloidal G-250 protocolo de tinción de acuerdo con Kang
Other articles by Sabine Metzger on PubMed
In Vitro La Fosforilación Del Sustrato 1 Del Receptor De Insulina Por La Proteína Quinasa C-zeta: Análisis Funcional Y La Identificación De Sitios De Fosforilación Novedosos
La proteína quinasa C-zeta (PKC-zeta) participa tanto en la señalización de insulina aguas abajo y en el control de retroalimentación negativa de la acción de la insulina. Aquí hemos utilizado un enfoque in vitro para identificar la PKC-zeta en los sitios de fosforilación del sustrato del receptor de insulina 1 (IRS-1) y para caracterizar las implicaciones funcionales. Un recombinante IRS-1 fragmento (RIR-1 (449) (-) (664)) que contiene los principales motivos de tirosina para la interacción con el fosfatidilinositol (PI) 3-quinasa fuertemente asociada a la subunidad p85alpha de la PI 3-quinasa después de la fosforilación de la Tyr del receptor de insulina. La fosforilación de la respuesta impulsiva-1 (449) (-) (664) por la PKC-zeta indujo una inhibición importante de este proceso con una mezcla de isoformas clásicas de PKC son menos eficaces. Tanto la PKC-zeta y las isoformas clásicas fosforilados RIRs 1 (449) (-) (664) en Ser (612). Sin embargo, la modificación de este residuo no reduce la afinidad de unión a p85alpha pTyr que contienen péptidos (aminoácidos 605-615 de la rata del IRS-1), según lo determinado por la resonancia de plasmón superficial. RIRs 1 (449) (-) (664) se fosforiló entonces por PKC-zeta utilizando [(32) P] ATP y se sometió a phosphopeptide cartografía tríptico basado en dos dimensiones HPLC acoplado a espectrometría de masas. Ser (498) y Ser (570) fueron identificados como sitios fosfoserina nuevos destinatarios de la PKC-zeta. Ambos sitios se confirmó adicionalmente mediante mapeo fosfopéptido de la Ser correspondiente -> Ala mutantes de la respuesta impulsiva-1 (449) (-) (664). Ser (570) fue dirigida específicamente por la PKC-zeta, como se muestra por inmunotransferencia con un antisuero contra fosfoespecífico Ser (570) de IRS-1. La unión de p85alpha para el mutante S570A era menos susceptible a la inhibición por la PKC-zeta, cuando se compara con el mutante S612A. En conclusión, nuestros datos in vitro demuestran una fuerte acción inhibidora de la PKC-zeta en el nivel de IRS-1/PI 3-quinasa interacción que implica múltiples sitios de fosforilación de serina. Considerando Ser (612) aparece no participar en el control negativo de señalización de la insulina, Ser (570) puede, al menos parcialmente contribuir a este proceso.
La Falta De La Mioglobina Produce Un Cambio En La Selección Del Soporte Cardíaco
La mioglobina es una importante hemoproteína O2 intracelular obligatorio en corazón y músculo esquelético. Sorprendentemente, la alteración de la mioglobina en ratones (mio-/ -) no dio lugar a fenotipo evidente y la función cardíaca normal se sugirió a ser mediada por alteraciones estructurales que tienden a steepen el gradiente de presión capilar a oxígeno de las mitocondrias. Aquí mostramos que la falta de la mioglobina produce un cambio bioquímico en la utilización de sustratos cardíaco de los ácidos grasos a la oxidación de la glucosa. Proteoma y el análisis de la expresión de genes descubrió las enzimas clave de la beta-oxidación mitocondrial, así como la de receptores nucleares PPAR ser regulados a la baja en la deficiencia de la mioglobina-corazones. Uso de la FDG-PET que mostró un aumento sustancial en la captación cardiaca in vivo de la glucosa en el mio-/ - ratones (6,7 + / -2,3 versus 0,8 + / -0,5% de la dosis inyectada en la de tipo salvaje, n = 5, P <0,001) , que se asoció con una regulación al alza del transportador de glucosa GLUT4. El interruptor metabólico fue confirmada por los estudios de 13C RMN isotopomer spetroscopic de corazones aislados, que revelaron que [1,6-13C2] la utilización de glucosa se incrementó en el mio-/ - corazones (38 + / -8% frente a 22 + / -5% en el medio silvestre tipo, n = 6, P <0,05), y en forma concomitante, [U-13C16] palmitato de la utilización se redujo en el grupo con deficiencia de la mioglobina (42 + / -6% frente a 63 + / -11% en la de tipo salvaje, n = 6, P <0,05). Debido al efecto ahorrador de O2 de la utilización de la glucosa, el cambio observado en la homeostasis del metabolismo de la energía sustrato beneficios y por lo tanto representa un proceso molecular que permite la adaptación para compensar la falta de oxígeno de la mioglobina compañía citosólica. Por otra parte, nuestros datos sugieren que un nivel de alteración de la mioglobina en sí puede ser un factor determinante para la selección del sustrato en el corazón. El texto completo de este artículo está disponible en http://circres.ahajournals.org.
Lipopolisacárido Inducida Por Nitración De Tirosina Y La Inactivación De Glutamina Sintetasa Hepática En La Rata
Glutamina sintetasa (GS) en el hígado está restringida a una población de hepatocitos perivenosa pequeño y juega un papel importante en el barrido de amoníaco que ha escapado a la periportal de urea-sintetizar compartimento. Se examinó el efecto de una única inyección intraperitoneal de lipopolisacárido (LPS) in vivo en la síntesis de glutamina en el hígado de rata. LPS inyección indujo la expresión de la sintasa de óxido nítrico inducible, que fue máxima al cabo de 6 a 12 horas, pero regresó a los niveles de control dentro de las 24 horas. Veinticuatro horas después de la inyección de LPS, alrededor de un aumento de cinco veces en tirosina-nitrados proteínas en el hígado se encontró, y la expresión de la proteína GS se redujo en aproximadamente un 20%, mientras que la actividad GS se redujo en un 40% a 50%. GS se encontró que era la tirosina-nitrados en respuesta a LPS, y immunodepletion de la tirosina-nitrados proteínas disminución de la proteína GS en aproximadamente un 50%, pero no tuvo ningún efecto sobre la actividad de GS. Junto con el hallazgo mediante espectrometría de masas que peroxinitrito inducida por la inactivación de purificada GS está asociado con la nitración del residuo tirosina sitio activo, nuestros datos sugieren que la nitración de tirosina críticamente contribuye a la inactivación de la enzima. De acuerdo con la inactivación de GS, la síntesis de glutamina a partir de amoníaco (0,3 mmol / L) en el hígado perfundido de 24 horas, las ratas tratadas con LPS se redujo en aproximadamente un 50%, mientras que la síntesis de urea no se vio afectada de manera significativa. En conclusión, el LPS afecta la desintoxicación hepática amoníaco por tanto regulación a la baja de la SG y su inactivación por la nitración de la tirosina. El defecto resultante de la función celular perivenosa tesoro con lo que se refiere a la eliminación de amoniaco pueden contribuir a la sepsis inducida por el desarrollo de hiperamonemia en pacientes que tienen cirrosis.
El Polisacárido Cadalso De PrP 27-30 Es Un Compuesto Común De Los Priones Naturales Y Se Compone De Alfa-vinculado Poliglucosa
Un polisacárido inerte andamio identificado como un componente de 5-15% de varillas priónicas (PrP 27-30) es inequívocamente distinguible de los grupos N-glicosilo y el ancla GPI de PrP, y compuesta fundamentalmente de 1,4-ligado de glucosa con alguna ramificación a través de 1,4,6-linked glucosa. Se demuestra que este polisacárido andamio es un componente secundario común de los priones se encuentran en hámster de larga duración PrP (Sc), barras de priones de ratón y en los priones ScN2a del cultivo de células. La preparación de las barras de priones fue mejorada, lo que resulta en un polisacárido andamio libre de la infectividad restante. Además, se determinó la estereoquímica de los enlaces glicosídicos como predominantemente, si no enteramente alfa-glicosídico. El origen del polisacárido, su interacción con PrP y su relación potencial de glucógeno y amylacea corpus se discuten.
El Oxígeno Singlete Desactiva Proteína Tirosina Fosfatasa-1B Por La Oxidación De La Cisteína Del Sitio Activo
El oxígeno singlete ((1) O (2)), una forma electrónicamente excitada de oxígeno molecular, es un mediador de los efectos biológicos de la radiación ultravioleta A, estimulando cascadas de señalización en las células humanas. Estamos aquí demostrar que (1) O (2) generado por fotosensibilización o thermodecomposition de 3,3 '- (1,4-naphthylidene) dipropionato-1 ,4-endoperóxido inactiva la proteína fosfatasa de tirosina (PTPases aislados). Actividades PTPasa de PTP1B o CD45 fueron abolidas por bajas concentraciones de (1) O (2), pero fueron restauradas en gran medida por el post-tratamiento con ditiotreitol. Ionización electrospray análisis de espectrometría de masa de tríptico digiere de PTP1B expuesto a (1) O (2) reveló la oxidación de sitio activo Cys215 como el residuo de cisteína oxidada solamente. En resumen, (1) O (2) pueden activar cascadas de señalización al interferir con la desfosforilación fosfotirosina.
Control De Cambios En La Conformación Durante El Ciclo Catalítico De OpuAA, La Subunidad De La ATPasa Opua Transportador ABC De Bacillus Subtilis
El transportador ABC (ATP-binding-cassette transportador) Opua es uno de los cinco sistemas de transporte de membrana en Bacillus subtilis que median osmoprotección mediante la importación de solutos compatibles. Al igual que todos los transportadores ABC bacterianos y archaeal que catalizan la importación de sustratos, Opua (donde Opu es absorción osmoprotector) se compone de una subunidad ATPasa (OpuAA), una subunidad transmembrana (OpuAB) y un sustrato extracelular de unión a proteínas (OpuAC). A diferencia de muchos conocido ABC-ATPasas, OpuAA se compone no sólo de un catalizador y un dominio helicoidal, sino también de un dominio de accesorios situado en su extremo C-terminal. El paradigma de este tipo de arquitectura es Malk, el ABC-ATPasa del importador de maltosa de Escherichia coli, que cuentan con información detallada estructural y funcional está disponible. En el presente estudio, hemos aplicado una solución FRET (transferencia de energía Förster resonancia) utilizando técnicas de dos mutantes de cisteína individuales para obtener información estructural inicial en la arquitectura del dímero OpuAA en la solución. Del análisis de los resultados en detalle y compararlas con las estructuras existentes Malk reveló que los dominios catalíticos y helicoidales adoptó un acuerdo similar a los de Malk, mientras que las profundas diferencias en la orientación en tres dimensiones del dominio de accesorios, que contiene dos CBS (cistationina beta -sintetasa) dominios, se observaron. Estos resultados arrojan nueva luz sobre el papel de este presente de dominio de accesorios en un cierto subconjunto de ABC-ATPasa en el perfeccionamiento de la estructura tridimensional de las funciones biológicas.
Análisis Genéticos Y Bioquímicos De La Serina / Treonina Proteína Quinasas PknA, PknB, PknG Y PknL De Corynebacterium Glutamicum: La Evidencia De Su Carácter No Esencial Y De La Fosforilación De OdhI Y FtsZ Por Múltiples Quinasas
Anteriormente puso de manifiesto que el 2-oxoglutarato deshidrogenasa inhibidor de la proteína OdhI de Corynebacterium glutamicum es fosforilada por PknG en Thr14, sino que también serina adicional / treonina cinasas de proteínas (STPKs) puede fosforilar OdhI. Para identificar a estos, un conjunto de tres simple (DeltapknA, DeltapknB, DeltapknL), doble cinco (DeltapknAG, DeltapknAL, DeltapknBG, DeltapknBL, DeltapknLG) y dos triples mutantes de deleción (DeltapknALG, DeltapknBLG) fueron construidos. La existencia de estos mutantes muestra que PknA, PknB, PknG y PknL no son esenciales en C. glutamicum. Análisis del estado de fosforilación OdhI en las cepas mutantes reveló que todos los cuatro STPKs pueden contribuir a la fosforilación OdhI, con PknG siendo el más importante. Sólo mutantes en los que se ha eliminado pknG mostraron una inhibición del crecimiento fuerte en placas de agar que contienen glutamina como fuente de carbono y nitrógeno. Thr14 y Thr15 de OdhI, se mostró a ser fosforilados in vivo, ya sea individualmente o de forma simultánea, y la evidencia para un máximo de dos sitios de fosforilación adicionales se obtuvo. Desfosforilación de OdhI ha demostrado ser catalizada por la phospho-Ser/Thr proteínas fosfatasa PPP. Además OdhI, la división celular FtsZ proteína fue identificada como sustrato de PknA, PknB y PknL y del PPP fosfatasa, lo que sugiere un papel de estas proteínas en la división celular.
Caracterización De La O-phosphohydroxyproline Rat {alpha}-cristalina A
Post-translacional modificaciones tienen gran importancia para la estructura y función de una multiplicidad de proteínas. La fosforilación es un fenómeno generalizado entre las proteínas eucariotas. Considerando O-fosforilación en las cadenas laterales de serina, treonina y tirosina en proteínas es bien conocida y ha sido estudiada extensamente, a nuestro conocimiento la fosforilación endógena de hidroxiprolina no ha sido previamente reportado. En el presente trabajo, nos proporcionan la prueba por primera vez que O-phosphohydroxyproline (Hyp (P)) es un aminoácido proteinogenic. Para detectar Hyp (P) en las proteínas que genera una Hyp (P)-anticuerpo específico policlonal. Podríamos identificar Hyp (P) en varias proteínas por Western blot, y que caracteriza la posición de la secuencia de Hyp (P) en la proteína α-cristalina A por ionización electrospray-espectrometría de masas. Nuestros experimentos demuestran claramente hidroxilación y posterior fosforilación de un residuo de prolina en α-cristalina A en el ojo, así como en el tejido del corazón de rata.
Purificación Fácil Y Rápida De La Nisina Altamente Activa
La nisina es un péptido antimicrobiano producido y secretado por varios cepas de L. lactis y está específicamente activo contra bacterias Gram-positivas. En estudios previos, la nisina se purificó mediante cromatografía de intercambio catiónico a un pH bajo empleando una elución de un solo paso utilizando 1 M de NaCl. A continuación, describimos un protocolo de purificación optimizado utilizando una elución de NaCl de cinco pasos para eliminar los contaminantes. La nisina obtenida está desprovisto de impurezas y muestra alta actividad bactericida contra la cepa sensible a la nisina L. lactis NZ9000. Purificada nisina exhibe un IC (50) de ~ 3 nM, que es una mejora importante en comparación a la nisina obtenido mediante el procedimiento de elución de un solo paso.
La Identificación De Un Factor De Crecimiento Fibroblástico (FGF-1) En Un Producto De Mercado Negro
El uso de factores de crecimiento para acelerar la curación de las lesiones deportivas se limita bajo los términos de la World Anti-Doping Agency (WADA) código antidopaje. Los atletas de engaño han utilizado el mercado negro como fuente de sustancias para mejorar el rendimiento. Los medicamentos que actualmente se someten a los ensayos clínicos se ofrece con frecuencia - a pesar de los riesgos para la salud desconocidos asociados con la administración de fármacos no aprobados. Recientemente, un nuevo factor de crecimiento (denominado factor de crecimiento de fibroblastos 1/FGF-1) con los efectos conocidos sobre la reparación y regeneración del tejido dañado se detectó en un mercado de productos sin etiqueta negro confiscado por las aduanas alemanas. La identificación de la proteína se logró mediante electroforesis en gel de uno y de dos dimensiones-poliacrilamida (SDS-PAGE y 2D-PAGE), diferentes digestiones proteolíticas, métodos inmunológicos y nano-líquido high-resolution/high-accuracy cromatografía espectrometría de masas Orbitrap. El análisis de SDS-PAGE reveló ligeras diferencias relativas al peso molecular de recombinante humano y mercado negro FGF-1. Utilizando en gel proteólisis, un truncamiento o modificación situado en el extremo N-terminal de la proteína se sugirió. Estos hallazgos demuestran que los candidatos de drogas sin la aprobación clínica se pueden obtener fácilmente en el mercado negro, a pesar de las posibles consecuencias peligrosas para el consumidor, lo que corrobora la necesidad de enfoques proactivos y preventivos de control de dopaje. A este respecto, las concentraciones fisiológicas de las muestras de sangre y orina recogidas de individuos sanos se analizaron y se encontró que oscilan por debajo de 28 pg / ml en la orina, mientras que no hubo detectable FGF-1 en el plasma.
