Il Dominio Del Convertitore Di Miosina Modula Le Prestazioni Muscolari

Nature Cell Biology. Apr, 2002  |  Pubmed ID: 11901423

Miosina è il motore molecolare che alimenta la contrazione muscolare a seguito di cambiamenti conformazionali durante il suo ciclo mechanochemical. Dimostriamo che il convertitore, un compatto dominio strutturale che differisce in sequenza tra isoforme di miosina di Drosophila melanogaster, influenza notevolmente le proprietà cinetiche delle fibre di miosina e muscolare. Transgenici sostituzione del convertitore nel muscolo volo veloce indiretta con il convertitore da un muscolo embrionale rallentato cinetica muscolare, costringendo una riduzione compensativa in ala frequenza di battimento per sostenere il volo. Al contrario, sostituendo il convertitore embrionale con il convertitore di muscolo di volo accelerato cinetica muscolare e aumento potenza massima duplice, rispetto ai muscoli di volo esprimendo l'isoforma della miosina embrionale. Le sostituzioni anche notevolmente influenzato actina in vitro velocità di strisciamento, suggerendo che il convertitore modula un limitazione della velocità passo precedente distacco cross-bridge. La nostra analisi integrativa dimostra che differenze isoform specifico nel convertitore miosina consentono tipi muscolari differenti soddisfare le loro richieste specifiche di locomozione.

Il Dominio Convertitore Modula Proprietà Cinetiche Di Miosina Drosofila

American Journal of Physiology. Cell Physiology. Apr, 2003  |  Pubmed ID: 12477668

Recentemente il dominio del convertitore, parte integrante del comune "elemento meccanico" per motori tutti molecolari, è stato proposto di modulare le proprietà cinetiche delle isoforme di miosina chimerico drosofila. Qui abbiamo studiato le basi molecolari della velocità di filamenti di actina (V(actin)) cambiamenti osservati in precedenza con il chimerica IFI-InterCity ed EMB miosina proteine [l'embrionale corpo parete muscolare (EMB) e indiretta volo muscolare isoforme (IFI) con sostituzione genetica dei domini convertitore IFI ed EMB, rispettivamente]. Nel saggio trappola laser le IFI e IFI-CE myosins generare la stessa cilindrata unitaria passo (IFI = 7.3 + /-1,0 nm, IFI-CE = 5,8 + 0,9 nm; mezzi + /-SE). Così convertitore-mediata le differenze nella cinetica di actina-miosina forte associazione, piuttosto che le capacità meccaniche della proteina, devono tenere conto per i valori osservati di V(actin). Dosaggi basali e actina-attivato ATPasi e scuoiati fibra meccanica esperimenti definitivamente supportano un ruolo per il dominio del convertitore nel modulare le proprietà cinetiche della proteina miosina. Proponiamo che il dominio convertitore coppie cineticamente la procedura di rilascio P(i) e ADP che si verifica durante il ciclo cross-bridge.

Variabile Regioni N-terminale Della Catena Pesante Della Miosina Del Muscolo Modulano Tasso ATPasi E Actina Velocità Di Strisciamento

The Journal of Biological Chemistry. May, 2003  |  Pubmed ID: 12606545

Abbiamo valutato integratively la funzione di versioni alternative di una regione nei pressi del capolinea N della drosofila muscolare miosina pesante catena (codificato dall'esone 3a o 3b). Ci siamo scambiati le regioni tra un'isoforma embrionale e l'isoforma muscolare indiretto volo alternativo esone 3. Ciascuna miosina chimerica è stata espressa nel muscolo di volo indiretto della drosofila, in assenza di altre isoforme di miosina, permettendo l'analisi della proteina purificata e locomotoria studi tutto l'organismo. L'isoforma muscolare volo genera actina in vitro superiore scorrevole Velocità e soluzione tariffe ATPasi rispetto l'isoforma embrionale. Lo scambio della regione embrionale esone 3 nel muscolo volo isoforma diminuiti tassi di ATPasi a livelli embrionali ma non influenzano la velocità di scorrimento dell'actina o volo ultrastruttura del muscolo. Curiosamente, questo swap solo leggermente alterata capacità di volo. Lo scambio della regione muscolare specifico exon 3 volo nell'isoforma embrionale aumentata velocità di strisciamento 3 volte actina e migliorata l'integrità di ultrastruttura muscolare indiretto volo ma non è riuscito a salvare il fenotipo incapace di volare di mosche esprimendo la miosina embrionale. Questi risultati suggeriscono che le due versioni strutturali del dominio esone 3 influenzano indipendentemente la cinetica di almeno due passaggi del ciclo cross-bridge actomiosina.

Drosofila Swanny è Importante Per La Fusione Del Myoblast Ed Essenziale Per La Formazione Di Miofibrille

The Journal of Cell Biology. Mar, 2003  |  Pubmed ID: 12642615

Swanny è un'importante proteina strutturale dei filamenti spessi nei muscoli degli invertebrati. Dimero coiled-coil di Swanny forma un nucleo paracristallina di questi filamenti, e la miosina proteina motore è disposto sulla superficie del nucleo. Per studiare la funzione di Swanny Miofibrilla assembly e contrazione del muscolo, abbiamo interrotto funzionalmente il gene di Drosophila melanogaster Swanny mobilitando un elemento di P, situato nella regione del promotore. Swanny omozigoti mutanti muoiono in fase tardiva dell'embrione. Mutanti display difetti in entrambi fusione del myoblast e nell'assembly miofibrille nei muscoli della parete del corpo embrionale. Embrioni mutanti hanno un modello di fibra muscolare anormale della parete di corpo derivanti da difetti di fusione del myoblast. Inoltre, unità sarcomero non assemblare correttamente e contrattilità muscolare è compromessa. Abbiamo confermato che questi difetti sono Swanny specifiche di salvataggio Swanny omozigote mutante all'età adulta con un transgene Swanny. Analisi dell'anticorpo di embrioni normali ha dimostrato che Swanny si accumula come una proteina citoplasmatica nello sviluppo iniziale dell'embrione prima del montaggio in filamenti spessi. Concludiamo che Swanny svolge un ruolo inaspettato nella fusione del myoblast ed è importante per Miofibrilla assieme e muscolo contrazione.

Le Proteine UCS: Gestione Del Motore Miosina

Current Biology : CB. Jul, 2003  |  Pubmed ID: 12842031

Studi recenti indicano che motori molecolari miosina interagiscano all'interno delle cellule con le proteine contenenti un dominio conservato 'UCS'. Questo appare per garantire il corretto ripiegamento delle teste di miosina così che essi possono svolgere le loro funzioni motore basato su actina ATP-dipendente.

Analisi Cinetica Di Drosofila Isoforme Di Miosina Muscolare Suggeriscono Una Romanzo Modalità Di Accoppiamento Mechanochemical

The Journal of Biological Chemistry. Dec, 2003  |  Pubmed ID: 14506231

Il meccanismo molecolare della funzione della miosina è stato indirizzato da misurare parametri cinetici transitori della naturalmente e chimerici isoforme di miosina muscolare drosofila. Abbiamo valutato l'isoforma embrionale nativa, l'isoforma muscolare nativo volo indiretto e due isoforme chimerici contenenti convertitore domini scambiati tra il muscolo volo indiretto e isoforme embrionale. Miosina è stata purificata da muscoli indiretti volo delle mosche transgeniche e S1 è stato prodotto da digestione alfa-chymotryptic. Studi precedenti in vertebrato e capesante myosins hanno mostrato una correlazione tra velocità filamento dell'actina in saggi di motilità e tasso di cross-bridge distacco, in particolare il tasso di rilascio di ADP. Al contrario, il nostro studio ha mostrato alcuna correlazione tra la velocità di filamento tasso e actina del distacco in drosofila isoforme della miosina e ulteriormente che il dominio del convertitore non influenza significativamente la cinetica biochimica che regolano il distacco della miosina dall'actina. Suggeriamo che pressione evolutiva su un gene di miosina singolo muscolo può mantenere un tasso veloce distacco in tutte le isoforme. Di conseguenza, il tasso di attacco e il completamento del tratto il potere o l'equilibrio fra gli Stati actin.myosin.ADP può definire velocità di filamenti di actina per queste isoforme della miosina.

Alternative Regioni N-terminale Della Catena Pesante Della Miosina Drosofila Melodia Cinetica Muscolare Per Potenza Ottimale

Biophysical Journal. Sep, 2004  |  Pubmed ID: 15345559

Abbiamo valutato l'influenza delle versioni alternative di una regione nei pressi del N-terminale della catena pesante della miosina drosofila sulle proprietà meccaniche del muscolo. In precedenza, scambiati regioni N-terminale (codificati dall'esone alternativo 3s) tra un'isoforma embrionale (EMB) e l'isoforma del muscolo volo indiretta (IFI) di miosina e ha dimostrato che esso influenza soluzione ATPasi tariffe e actina in vitro velocità di strisciamento. Perché ogni miosina è espressa nel muscolo di volo indiretto della drosofila, in assenza di altre isoforme di miosina, questo permette muscolare meccanico e intero organismo locomozione dosaggi. Abbiamo trovato che lo scambio del muscolo di volo regione specifico exon 3 nell'isoforma embrionale (EMB-3b) aumentato di generazione di potenza massima (frequenza ottima della generazione di energia e P(max)) (f(max)) triplice e duplice rispetto alle fibre esprimendo EMB, considerando che lo scambio della regione embrionale esone 3 nell'isoforma muscolare di volo (IFI-3a) è diminuito di P(max) e f(max) per circa l'80% dei valori di fibra IFI. Drosofila esprimendo IFI-3a esposto una frequenza di battimento ala ridotta rispetto alle mosche che esprimono l'IFI, che ottimizzata la generazione di energia dal loro muscolo volo cineticamente rallentato. Tuttavia, l'ala più lento battere frequenza ha provocato una notevole perdita di potenza aerodinamico come manifesto in prestazioni di volo è diminuito di IFI-3a rispetto all'IFI. Così la regione N-terminale è importante nella regolazione cinetica della miosina per abbinare la velocità muscolare per ottenere prestazioni ottimali locomotoria.

Rigidità Passiva Di Miofibrille Drosofila IFM: Un Romanzo, Il Metodo Di Misurazione Ad Alta Precisione

Journal of Muscle Research and Cell Motility. 2004  |  Pubmed ID: 15548865

Come sottostruttura più piccola cellula muscolare che mantiene l'apparato contrattile intatto, la singola Miofibrilla è considerato il campione ottimo per meccanica muscolare, anche se il relativo di piccola dimensione pone anche alcune difficoltà tecniche. Miofibrille dal muscolo di volo indiretto di Drosophila (IFM) sono particolarmente difficili da studiare, perché la loro elevata rigidità passiva li rende difficili da gestire e troppo resistente per allungare per produrre sufficiente allungamento per la misurazione accurata del cambiamento di lunghezza del sarcomero. In questo studio, abbiamo messo a punto un nuovo metodo per la misurazione accurata rigidità delle singole miofibrille rilassate usando microfabricated cantilever e microscopia di contrasto di fase. Uno speciale protocollo sperimentale è stato sviluppato per ridurre gli errori, e alcune strategie di analisi dati sono stati utilizzati per identificare ed escludere dati spuri. Risultati notevolmente consistenti sono stati ottenuti da miofibrille drosofila IFM. Questo romanzo, metodo ad alta precisione è potenzialmente uno strumento efficace per la rilevazione di rigidità passiva piccolo cambiamento in mutanti di muscolo.

Drosofila Swanny è Importante Per La Fusione Del Myoblast Ed Essenziale Per La Formazione Di Miofibrille

The Journal of Cell Biology. Nov, 2004  |  Pubmed ID: 15557126

Swanny Perturbazione Di Fosforilazione Sito Influisce Sulla Rigidità Muscolare Indiretto Volo E Generazione Di Energia in Drosophila Melanogaster

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Jul, 2005  |  Pubmed ID: 16020538

La fosfoproteina Swanny è un importante componente strutturale della spessi filamenti muscolari degli invertebrati. Per studiare l'importanza della fosforilazione Swanny, abbiamo prodotto transgenico melanogaster della drosofila in cui uno, tre o quattro residui di serina phosphorylatable nel dominio N-terminale di nonhelical sono stati sostituiti da alanines. A seconda dei residui mutati, linee transgeniche sono state sia influenzata o gravemente volo compromessa. Ceppi con problemi di volo ha avuto diminuzioni nelle isoforme Swanny più acide, con un corrispondente aumento di isoforme più di base. Sorprendentemente, ultrastruttura delle miofibrille muscolari indiretti volo era normale, che indica la fosforilazione del N-terminale non è importante per l'assemblaggio di miofibrille. Tuttavia, studi meccanici delle fibre muscolari attiva indiretta volo ha rivelato che le mutazioni sito di fosforilazione ridotto moduli elastici e viscosi da 21-59% e la potenza di uscita massima fino al 42%. Riduzioni significative avvennero anche sotto rilassato e condizioni di rigore, che indica che le modifiche di fosforilazione-dipendente sono indipendenti di crossbridge forte attaccamento e probabilmente derivano da alterazioni nelle proprietà della spina dorsale di filamenti spessi. Sono stati osservati crossbridge ulteriore, normale cinetica, dimostrando che non funzione motore miosina subisce i mutanti. Possiamo concludere che la fosforilazione del N-terminale della drosofila Swanny è essenziale per forza ottima e trasduzione oscillatorio di potere all'interno della fibra muscolare ed è la chiave per l'elevata rigidità passiva dei muscoli di volo dell'insetto asincrona. Fosforilazione possa rafforzare le interazioni tra domini asta miosina, aumentare connessioni di filamenti spessi a M-linea centrale del sarcomero o stabilizzare le interazioni di filamenti spessi con proteine che contribuiscono alla rigidità della fibra.

Un Dominio Alternativo Nei Pressi Del Sito Di Nucleotide-binding Di Miosina Muscolare Drosofila Influisce Sulla Cinetica Dell'ATPasi

Journal of Molecular Biology. Oct, 2005  |  Pubmed ID: 16154586

In Drosophila melanogaster espressione delle isoforme di catena pesante della miosina muscolare si verifica da splicing alternativo di trascrizioni da un singolo gene. Il dominio di esone 7 è una delle quattro regioni variabile nella testa catalitica e si trova nei pressi del sito di nucleotide-binding. Per attribuire un ruolo funzionale a questo dominio, abbiamo creato due isoforme di miosina chimerico (volo indiretto isoform-esone 7a ed embrionale-esone 7 d) che differiscono dal muscolo nativo volo indiretto e muscolare della parete del corpo embrionale isoforme solo nella regione esone 7. Germinali trasformazione e conseguente espressione dei myosins chimerico nel muscolo volo indiretto della miosina-null Drosophila ci ha permesso di purificare la miosina per studi in vitro e di valutare in vivo, struttura e funzione dei muscoli transgenici. Curiosamente, esperimenti in vitro mostrano l'esone 7 dominio modula attività ATPasi della miosina ma non ha alcun effetto sulla velocità di filamento di actina, un romanzo risultato rispetto agli studi simili con altri esoni variabili della drosofila. Mosche transgenici che esprimono il volo indiretto isoform-esone 7a hanno struttura muscolo normale volo indiretti e volo e capacità di salto. Tuttavia, espressione delle embrionali esone 7 d isoforma chimerico rese incapaci di volare mosche che mostrano miglioramenti in entrambi la stabilità strutturale del muscolo del volo indiretti e nelle capacità locomotorie rispetto al vola esprimendo l'isoforma embrionale. Nel complesso, i nostri risultati suggeriscono che il dominio esone 7 partecipa nella regolazione dell'attacco della miosina all'actina al fine di ottimizzare le proprietà fisiologiche delle isoforme di miosina drosofila.

Un Dominio Alternativo Vicino Tasca ATP Binding Della Miosina Drosofila Influisce Sulla Cinetica Della Fibra Muscolare

Biophysical Journal. Apr, 2006  |  Pubmed ID: 16399836

Abbiamo esaminato l'importanza delle versioni alternative di una regione nei pressi del sito di legame ATP della drosofila miosina pesante catena di proprietà meccaniche del muscolo. In precedenza, abbiamo scambiato due versioni di questa regione (codificato dall'esone alternativo 7s) tra l'isoforma di miosina muscolare volo indiretta (IFI) e di un'isoforma della miosina embrionale (EMB) e trovato, sorprendentemente, che in vitro soluzione actina-attivato ATPasi tassi erano aumentate (Vmax superiore) di entrambi gli scambi esone. Qui abbiamo esaminato l'effetto dell'aumento della frequenza dell'ATPasi sulla meccanica di fibra muscolare (IFM) volo indiretto e locomozione della drosofila. IFM esprimendo EMB con dominio esone 7a sostituito dal dominio d 7 esone specifico dell'IFM (EMB-7D) esposto 3.2-fold maggiore potenza oscillatorio massima (Pmax) e 1.5-fold una maggiore frequenza ottima di energia elettrica (fmax) versus fibre esprimendo EMB. In contrasto, IFM esprimendo IFI con regione esone 7 d sostituita da regione 7a esone EMB (IFI-7a), ha mostrato alcun cambiamento in Pmax, fmax, risposta di punto o proprietà muscolare isometrica rispetto alle fibre di FII nativi. È stato osservato un leggero decremento nella capacità di volo di IFI-7a, suggerendo un'influenza negativa del tasso aumentato di ATPasi sulla locomozione drosofila, forse a causa di vincoli di approvvigionamento di energia. I nostri risultati mostrano che esone 7 gioca un ruolo notevole nello stabilire le prestazioni di volo e velocità di fibra, e che il passaggio limito che non imposta frequenza di ATPasi nella miosina Drosophila ha poco o nessun influenza diretta nell'impostazione fmax per i tipi di fibre muscolari veloci.

AlphaB-crystallin Mantiene L'attività Enzimatica Della Miosina Muscolo Scheletrico E Previene La Sua Aggregazione Sotto Stress Di Scossa Di Calore

Journal of Molecular Biology. May, 2006  |  Pubmed ID: 16546210

Qui, forniamo prove strutturali funzionali e diretta che quello alphaB-crystallin, un membro della famiglia di proteine di scossa di calore piccola, sopprime la spiegatura termica e aggregazione del motore molecolare miosina II. Miosina del muscolo scheletrico pollo era dispiegata termicamente alla temperatura di scossa di calore (43 gradi di C) in assenza e in presenza di crystallin alphaB. L'attività dell'ATPasi della miosina a 25 gradi C è stato utilizzato come parametro per monitorare il suo svolgimento. Miosina mantenuto solo il 65% e 8% della sua attività ATPasi quando incubati a temperatura di scossa di calore per 15 min e 30 min, rispettivamente. Tuttavia, 84% e il 58% delle attività dell'ATPasi della miosina è stata mantenuta quando essa è stata incubata con alphaB-crystallin alle stesse condizioni. Inoltre, actina-stimolato attività ATPasi della miosina è stato ridotto di circa il 90%, quando la miosina è stata dispiegata termicamente a 43 gradi C per 30 min, ma è stato ridotto da solo circa il 42% quando essa è stata incubata con alphaB-crystallin alle stesse condizioni. Legato thioflavin T fluorescenza e scattering di luce dosaggi indicati che miosina aggregati quando incubati a 43 gradi C per 30 minuti, mentre alphaB-crystallin soppressa questa aggregazione termica. Foto-etichetta bis-ANS alphaB-crystallin fluorescenza studi hanno confermato l'interazione transitorio di crystallin alphaB con miosina. Questi risultati sono stati ulteriormente supportati da microscopia elettronica delle molecole ombreggiate rotativi. Questo ha rivelato che circa il 94% delle molecole di miosina formate inter e intra-molecular aggregati quando incubati a 43 gradi C per 30 min alphaB-Crystallin, tuttavia, protetti circa il 48% delle molecole di miosina dall'aggregazione termica, con miosina protetta che appare identico a molecole non riscaldati. Questi risultati sono il primo a mostrare che crystallin alphaB mantiene l'attività enzimatica della miosina e impedisce l'aggregazione del motore in condizioni di scossa di calore. Così, alphaB-crystallin può essere critico per la nascente miosina pieghevole, esercitare la promozione myofibrillogenesis, mantenendo l'integrità del citoscheletro e sostenere la performance muscolare, poiché le temperature di scossa di calore possono essere prodotto durante condizioni di stress multipli o vigoroso.

Passivo Rigidità Muscolare Indiretto Volo Drosofila Ridotti Interrompendo Swanny Fosforilazione, Ma Non Da Miosina Embrionale Sostituzione Cerniera S2

Biophysical Journal. Dec, 2006  |  Pubmed ID: 17012313

Elevata rigidità passiva è una delle proprietà caratteristiche del muscolo asincrona volo indiretto (IFM) trovato in molti insetti come la drosofila. Per valutare gli effetti dei due domini di proteine di filamenti spessi sulla rigidità sarcomero passiva e di indagare la loro correlazione con la funzione IFM, abbiamo usato microfabricated cantilever e un'alta risoluzione sistema di imaging per lo studio della rigidità di Miofibrilla IFM passiva di due gruppi di linee transgeniche di Drosophila. Un gruppo (interruttore a cerniera mutanti) aveva una porzione della regione cerniera S2 endogena sostituita da una versione embrionale; l'altro gruppo (Swanny mutanti) ha avuto uno o più siti di fosforilazione putativo vicino il N-terminus di Swanny disabilitato. Entrambi i gruppi transgenici ha mostrato capacità di volo gravemente compromessa. In questo studio, abbiamo non trovato alcuna differenza (rispetto al controllo) nel modulo elastico passivo nel gruppo interruttore a cerniera, ma una riduzione del 15% i mutanti Swanny. Tutti i risultati sono stati corroborati da esperimenti di meccanica della fibra muscolare eseguiti sulla stessa linea. Il fatto che elasticità Miofibrilla è influenzato da cerniera di commutazione implica alternative S2 cerniere non influenzano criticamente rigidità passiva sarcomero. Al contrario, i difetti meccanici osservati su perturbano Swanny siti di fosforilazione in drosofila suggerisce che la fosforilazione Swanny è importante per mantenere elevata rigidità passiva in miofibrille IFM, probabilmente interessando l'interazione di Swanny con altre proteine del sarcomero.

Regolazione Trascrizionale Del Gene Della Drosofila Melanogaster Muscolare Miosina Catena Pesante

Gene Expression Patterns : GEP. Feb, 2007  |  Pubmed ID: 17194628

Dimostriamo che un frammento di 2,6 kb del gene muscolare miosina catena pesante (Mhc) di Drosophila melanogaster (contenente 458 paia di basi della sequenza a monte, il primo esone, il primo introne e l'inizio del secondo esone) unità di espressione in tutti i muscoli. Confronto tra il promotore minimo ai geni Mhc di 10 specie di Drosophila identificato putativi elementi regolatori della regione a monte e nel primo introne. Primo introne è necessaria per l'espressione in quattro piccole celle del depressore tergal del muscolo trocantere (salto) e nel muscolo volo indiretto. 3'-Estremità di questo introne è importante per la trascrizione di Mhc nella parete del corpo embrionale muscolare e contiene elementi AT-ricchi che sono protetti da dnasi I digestione di proteine nucleari di embrioni della drosofila. Responsabile dell'espressione nella parete del corpo embrionale, adulta e adulti muscoli testa le sequenze sono presenti sia all'interno che all'esterno dell'introne. Elementi importanti per l'espressione dei muscoli della gamba e nelle cellule del muscolo del salto grande fiancheggiano introne. Concludiamo che più elementi regolatori trascrizionali sono responsabili per l'espressione di Mhc in specifici gruppi di muscoli drosofila.

Regioni Di Cerniera S2 Alternativi Dell'asta Miosina Differenzialmente Possono Influenzare La Funzione Muscolare, Miofibrilla Dimensioni E Lunghezza Della Coda Della Miosina

Journal of Molecular Biology. Apr, 2007  |  Pubmed ID: 17316684

Domini di rod Muscle miosina catena pesante (MHC) si intrecciano per formare dimeri alfa-elicoidali di coiled-coil; questi successivamente multimerize in filamenti spessi tramite interazioni elettrostatiche. Regione subfragment meromyosin 2/luce "cerniera" dello stelo MHC, situato nel C-terminale terzo delle pesanti meromyosin, può formare un meno stabile coiled-coil rispetto delle regioni fiancheggianti. Parziale "fusione" di questa regione è stato proposto a causare un'elica di transizione bobina casuale. Una porzione della cerniera della drosofila melanogaster MHC è codificata da esoni alternativi escludono 15a e 15b, il cui uso correla con veloce (A cerniera) o lento (cerniera B) proprietà fisiologiche del muscolo. Per testare il significato funzionale delle regioni cerniera alternativo, abbiamo costruito linee fly transgenici in cui muscolo veloce isovariant cerniera A è stato commutato per cerniera lenta muscolo B in isoforme di MHC di volo indiretto e muscoli di salto. Sostituzione della cerniera lenta muscolo B alterata capacità di volo, lunghezze di sarcomero è aumentato di circa il 13% e ha portato in minori disagi alla struttura sarcomero muscolo volo indiretto rispetto ad un controllo transgenico. Con l'età, capacità residua di volo è diminuito rapidamente e miofibrille sviluppato difetti periferici. Analisi computazionale indicano che la cerniera B ha una maggiore propensione coiled-coil e così ridotta flessibilità rispetto a cerniera A. curiosamente, l'asta di MHC con cerniera B era circa 5 nm più di miosina con cerniera A, coerente con la più rigida conformazione coiled-coil previsto per cerniera B. Il nostro studio dimostra che cerniera B funzionalmente non può sostituire per cerniera A in tipi di muscolo veloce, probabilmente a causa di differenze nella struttura molecolare dell'asta, sottili cambiamenti nella struttura della Miofibrilla e diminuita capacità di mantenere la struttura del sarcomero in miofibrille muscolari volo indiretto. Così, cerniere alternativi sono importanti nel dettare le proprietà funzionali distinte delle isoforme di miosina e i muscoli in cui essi sono espressi.

Un Dominio Variabile Nei Pressi Del Sito ATP-binding in Miosina Muscolare Drosofila è Parte Del Percorso Di Comunicazione Tra I Nucleotidi E Siti Di Legame Dell'actina

Journal of Molecular Biology. May, 2007  |  Pubmed ID: 17379245

Drosofila esprime diverse isoforme di miosina muscolare da un singolo gene di splicing in alternativa sei i 19 esoni. Qui indaghiamo esone 7, che codifica per una regione di dominio superiore 50 kDa vicino la tasca nucleotide-binding. Questa regione è di interesse perché è anche il luogo dove si trova un grande inserto nella miosina VI e dove sono state identificate diverse mutazioni di cardiomiopatia di miosina cardiaca umana. Abbiamo espresso e purificato myosins chimerico muscolare da Drosophila, ogni variazione all'esone 7. Due chimere scambiati il dominio intero esone 7 tra volo indiretto muscolari (IFI, che normalmente contiene esone 7 d) e la parete del corpo embrionale muscolare (EMB, contenenti normalmente esone 7a) isoforme di creare d IFI-7a ed EMB-7. La seconda due chimere sostituito ogni metà del dominio esone 7a in EMB con la corrispondente porzione dell'esone 7 d per creare EMB-7a/7 d e d EMB-7/7a. Gli studi cinetici transitori del dominio motore da queste isoforme di miosina ha rivelato cambiamenti in diversi parametri cinetici tra le isoforme IFI o EMB e le chimere. Di significato sono stati cambiamenti nell'associazione di nucleotidi, che differiva in presenza e in assenza di actina, coerente con un modello in cui il dominio esone 7 è parte del percorso di comunicazione tra i nucleotidi e siti di legame dell'actina. Modelli di omologia delle strutture suggeriscono come il dominio di esone 7 potrebbe modulano questa via metabolica.

Mutazioni Di Miosina Trasduttore Influenzano Differenzialmente Funzione Motoria, Struttura Delle Miofibrille E La Performance Dei Muscoli Scheletrici E Cardiaci

Molecular Biology of the Cell. Feb, 2008  |  Pubmed ID: 18045988

Miosina del muscolo striato è un motore molecolare di trifosfato di Adenosina-dipendente multidominio. Alterazioni a vari domini influenzano le proprietà chemiomeccanica del motore, e sono associate a miopatie scheletriche e cardiache. Il dominio del trasduttore di miosina si trova nei pressi del sito di nucleotide-binding. Qui, abbiamo contribuito a definire il ruolo del trasduttore utilizzando un approccio integrativo per studiare come Drosophila melanogaster trasduttore mutazioni D45 e Mhc(5) influenzano la funzione della miosina e struttura del muscolo scheletrico e cardiaco e prestazioni. Abbiamo trovato D45 miosina (A261T) ha depresso attività ATPasi e motilità actina in vitro, mentre Mhc(5) (G200D) miosina ha queste proprietà avanzate. Attività di miosina depresso D45 protegge contro disfunzioni associate all'età metabolicamente più esigenti nei muscoli scheletrici. Al contrario, una migliore funzione di miosina Mhc(5) permette il montaggio di Miofibrilla scheletrico normale, ma induce la degradazione dell'apparato miofibrillare, probabilmente a causa della disinibizione contrattile. Analisi di battere cuori dimostra depressa funzione motoria evoca una risposta dilatorio, simile a quello visto con mutazioni di miosina vertebrati cardiomiopatia dilatativa, e sconvolge la ritmicità contrattile. Prestazioni migliorate della miosina genera un fenotipo apparentemente analogo a quello della cardiomiopatia restrittiva umana, possibilmente indicando origini basate su miosina per la malattia. Le mutazioni D45 e Mhc(5) illustrano il ruolo del trasduttore nell'influenzare le proprietà chemiomeccanica di miosina e producono patologie uniche nei muscoli distinti. I nostri dati suggeriscono che Drosophila è un sistema valido per identificare e modellazione mutazioni analoghe a quelle associata a disturbi muscolo umano specifico.

Domini Alternativi Relè Di Miosina Melanogaster Della Drosofila Influenzano Differenzialmente Attività ATPasi, Motilità in Vitro, Funzione Di Struttura E Muscolo Miofibrilla

Journal of Molecular Biology. Jun, 2008  |  Pubmed ID: 18462751

Il dominio di inoltro della miosina è ipotizzato per funzionare come un percorso di comunicazione tra il sito di nucleotide-binding, il sito di legame dell'actina e il dominio del convertitore. In Drosophila melanogaster, un gene della catena pesante della miosina singolo codifica tre domini alternativi relè. 9A esone codifica il dominio di inoltro indiretta volo muscolare isoform (IFI), considerando che 9b esone codifica per uno dei domini parete del corpo embrionale isoform (EMB) relè. Per ottenere una migliore comprensione della funzione del dominio di inoltro e le differenze impartite da FII e le versioni EMB, abbiamo costruito due linee di drosofila transgenici che esprimono catene pesanti della miosina chimerico in muscoli indiretti volo privo di miosina endogena. Uno esprime il dominio di inoltro IFI nella spina dorsale EMB (EMB-9a), mentre il secondo esprime il dominio di inoltro EMB nella spina dorsale IFI (IFI-9b). I nostri studi rivelano che il dominio di inoltro EMB è funzionalmente equivalente al dominio IFI relè quando esso è sostituito in IFI. Essenzialmente non nell'attività dell'ATPasi, velocità di scorrimento dell'actina, capacità di volo a temperatura ambiente o struttura muscolo sono osservate differenze rispetto al nativo IFI IFI-9B. Tuttavia, quando il dominio di inoltro EMB è sostituito con il dominio di inoltro IFI, troviamo una riduzione del 50% in attività ATPasi actina-attivato, un significativo aumento di affinità dell'actina, abolizione dell'actina scorrevole, difetti di assemblaggio Miofibrilla e rapida degenerazione della struttura muscolare rispetto all'EMB. Ipotizziamo che relè alterato dominio alterazioni conformazionali EMB-9a compromettere la comunicazione intramolecolare con il dominio di convertitore EMB-specifico. Questo diminuisce i tassi di transizione che coinvolgono stati fortemente associato actomiosina, portando ad un ridotto tasso di ATPasi e perdita di motilità actina.

Analogie E Differenze Tra Congelati-idratata, Rigore Acto-S1 Complessi Del Volo Degli Insetti E Dei Muscoli Scheletrici Di Pollo

Journal of Molecular Biology. Sep, 2008  |  Pubmed ID: 18588896

La struttura e la funzione della miosina crossbridges nel muscolo asincrona volo dell'insetto (IFM) sono state chiarite in situ utilizzando approcci multipli. Questi includono la generazione di modelli "atomici" di miosina in più Stati contrattile ricostruendo la struttura di cristallo di subfragment di pollo 1 (S1) per adattarsi crossbridges IFM in bassa risoluzione microscopia elettronica tomograms e di "mappatura" gli effetti funzionali dei domini geneticamente sostituiti, isoforma specifica, compreso il dominio del convertitore, in chimerico miosina IFM alle sequenze della struttura di cristallo del pollo S1. Abbiamo preparato ricostruzioni elicoidale (circa 25 risoluzione) per confrontare le caratteristiche strutturali del nucleotide-free myosin0 che S1 legata all'actina (acto-S1) isolato dal muscolo scheletrico di pollo (CSk) e i muscoli di volo di Lethocerus (Leth) wild-type drosofila (wt Dros) e una chimera di Drosophila (IFI-CE) in cui il dominio del convertitore dell'isoforma della miosina muscolare indiretto volo è stato sostituito dal dominio di convertitore miosina scheletrico embrionale. Sovrapposizione delle mappe dei complessi congelati-idratato acto-S1 dimostra che le differenze tra CSk e IFM S1 sono limitate alla curvatura azimutale del braccio di leva: la regione di regolamentazione luce-catena (RLC) di pollo scheletrico S1 si piega in senso orario (come visto dall'estremità appuntita di actina) mentre quelli del progetto S1 IFM in senso radiale dritto. Tutti i S1s IFM sono essenzialmente identici diverso da qualche variazione nella diffusione azimutale di densità nella regione RLC. Questa diffusione è più pronunciata in S1 IFI-CE, coerente con le proposte che il dominio embrionale convertitore aumenta la compliance del braccio di leva IFM che interessano la funzione del motore miosina. Questi sono i primi modelli senza vincoli di IFM S1 legata all'actina e il primo confronto diretto tra i vertebrati e invertebrati scheletrico miosina II classi, quest'ultime per cui, dati sulla struttura dei complessi discreti acto-S1, non sono prontamente disponibili.

Versioni Alternative Del Dominio Relay Miosina Differenzialmente Rispondono Per Caricare Per Influenzare La Cinetica Muscolare Della Drosofila

Biophysical Journal. Dec, 2008  |  Pubmed ID: 18805920

Abbiamo misurato l'influenza delle versioni alternative del dominio di inoltro di Drosophila melanogaster miosina catena pesante sulle proprietà meccaniche del muscolo. Ci siamo scambiati le regioni di dominio relay (codificati da versioni alternative di esone 9) tra un'isoforma embrionale (EMB) e l'isoforma del muscolo volo indiretta (IFI) della miosina. In precedenza, abbiamo non osservato alcun effetto di scambio la regione di dominio di inoltro EMB nell'isoforma muscolare di volo (IFI-9b) su actina in vitro motilità velocità o soluzione ATPasi misurazioni rispetto all'IFI. Tuttavia, nelle fibre muscolari volo indiretto, IFI-9b esposto è diminuito generazione potenza massima (P(max)) e frequenza ottima di energia elettrica (f(max)) al 70% e l'83% dei valori di fibra IFI. Il calo delle prestazioni muscolari ridotto la capacità di volo e la frequenza di ala-beat di IFI-9b drosofila rispetto all'IFI della drosofila. In precedenza, abbiamo scoperto che lo scambio di dominio specifico relè volo muscolare nell'isoforma EMB (EMB-9a) impedito il movimento actina nel saggio in vitro motilità rispetto all'EMB, che supportano il movimento dell'actina. Tuttavia, nelle fibre muscolari indiretti volo EMB-9a era un motore altamente efficace, aumentando P(max) e f(max) 2.5-fold e 1.4-fold, rispettivamente, rispetto alle fibre esprimendo EMB. Proponiamo che il carico oscillatorio che EMB-9a esperienze nella fibra muscolare riduce una barriera di energia di attivazione elevata tra due stati fortemente legati del ciclo cross-bridge, promuovendo così la croce-ponte in bicicletta. Maggiore sensibilità del dominio IFI relè per caricare aumenta cinetica cross-bridge, mentre la versione EMB è meno sensibile al carico.

L'europeo XXXVII Conferenza Del Muscolo: Oxford, Settembre 2008

Journal of Muscle Research and Cell Motility. 2008  |  Pubmed ID: 19034677

Domini Di Inoltro Con Codifica 9 Esoni Alternativi Possono Influenzare Più Di Una Via Di Comunicazione Nella Testa Della Miosina Drosofila

Journal of Molecular Biology. Jun, 2009  |  Pubmed ID: 19393244

Abbiamo studiato le proprietà biochimiche e biofisiche di una delle quattro regioni alternative all'interno del dominio catalitico di miosina drosofila: il dominio di relè codificato dall'esone 9. Questo dominio della testa della miosina trasmette cambiamenti conformazionali in tasca nucleotide-binding per il dominio del convertitore, che è fondamentale per l'attività catalitica di accoppiamento con movimento meccanico del braccio di leva. Per studiare la funzione di questa regione, abbiamo usato myosins chimerico (IFI-9b ed EMB-9a), che sono state generate dal cambio dei domini esone 9-codificati tra la parete del corpo embrionale nativa (EMB) e indiretta volo muscolare isoforme (IFI). Cinetiche misurazioni mostrano che exchange della regione esone 9-codificato altera le proprietà cinetiche di miosina S1 testa. Questo si riflette in valori ridotti per la costante di velocità di dissociazione indotta da ATP actomiosina (K(1)k(+2)) e ADP affinità (K(AD)), misurata per i costrutti chimerici IFI-9b ed EMB-9a, rispetto ai valori IFI ed EMB wild-type. Modelli di omologia indicano che, oltre che interessano la via di comunicazione tra la tasca del nucleotide-binding e il convertitore di dominio, lo scambio dei domini di relè tra IFI ed EMB colpisce la via di comunicazione tra la tasca del nucleotide-binding e il sito di legame actina nel dominio inferiore di 50 kDa (ciclo 2). Questi risultati suggeriscono un importante ruolo di dominio di inoltro nella regolazione della cinetica di actomiosina cross-bridge.

Regioni Di Cerniera S2 Alternativi Dell'asta Della Miosina Possono Influenzare Struttura Miofibrillare E Cinetica Di Miosina

Biophysical Journal. May, 2009  |  Pubmed ID: 19450484

La regione subfragment meromyosin 2/luce "cerniera" è stato proposto di contribuire significativamente alla forza di contrazione del muscolo e/o velocità. Transgenica sostituzione della cerniera isovariant endogeni muscolo veloce che a (esone 15a) in Drosophila melanogaster indiretta volo muscolare con la cerniera del muscolo lento B (esone 15b) consente l'esame dei cambiamenti strutturali e funzionali quando solo questa regione della molecola di miosina è diversa. Cerniera B precedentemente è stato indicato per aumentare la lunghezza di canna di miosina, aumentare la lunghezza A-band e sarcomero e diminuire le prestazioni di volo rispetto alla cerniera A. Abbiamo applicato le misure supplementari per queste linee transgeniche per valutare ulteriormente le conseguenze della modifica di questa regione cerniera. Strutturalmente, la più lunga A-band e lunghezze di sarcomero trovate nelle miofibrille B cerniera sembrano essere dovuto l'aggiunta longitudinale delle teste di miosina. Funzionalmente, cerniera B, sebbene una distanza significativa dal dominio catalitico della miosina, altera la cinetica della miosina in modo coerente con questa regione aumento lunghezza asta miosina. Questi cambiamenti strutturali e funzionali si combinano per diminuire tutta Mosca ala-beat volo e frequenza delle prestazioni. I nostri risultati indicano che questa regione cerniera gioca un ruolo importante nel determinare la cinetica di miosina e nella regolazione spessore e lunghezza del filamento sottile così come lunghezza del sarcomero.

Mutando L'interfaccia Convertitore-relè Di Miosina Drosofila Sconvolge ATPasi Attività, Motilità Actina, Miofibrilla Stabilità E Capacità Di Volo

Journal of Molecular Biology. May, 2010  |  Pubmed ID: 20362584

Abbiamo usato un approccio integrativo per sondare l'importanza dell'interazione tra il dominio di loop e convertitore relè del motore molecolare della miosina da muscolare indiretto volo di Drosophila melanogaster. Durante il ciclo mechanochemical miosina, ATP-indotta torsione del ciclo relè è ipotizzato per riposizionare il convertitore, con conseguente armamento del braccio di leva contigui nella configurazione pre-power ictus. Il successivo movimento del braccio di leva attraverso il relativo colpo di alimentazione genera contrazione muscolare provocando teste di miosina a tirare sui filamenti di actina. Abbiamo generato una linea transgenica che esprimono miosina con una mutazione nel dominio converter (R759E) in un sito di interazione ciclo relè. Modellazione molecolare suggerisce che l'interfaccia tra il dominio di inoltro loop e convertitore di R759E miosina sarebbe essere significativamente danneggiata durante il ciclo di mechanochemical. La mutazione depresso calcio così come MgATPase basale e actina-attivato (V(max)) da circa il 60% rispetto al wild-type miosina, ma non non c'è nessun cambiamento nell'affinità apparente actina (K(m)). Mentre ATP o AMP-PNP (adenil-imidodiphosphate) associazione a miosina selvaggio-tipo subfragment-1 enhanced fluorescenza del triptofano in circa 15% o circa l'8%, rispettivamente, valorizzazione non si verificano in mutante. Questo suggerisce che la mutazione riduce il movimento del braccio di leva. La mutazione diminuisce la motilità in vitro dei filamenti di actina di circa il 35%. Muscoli di volo indiretto pupa mutante visualizzare Miofibrilla normale Assemblea, forma Miofibrilla e doppio-esagonale disposizione dei filamenti spessi e sottili. Due-giorno-vecchio fibre hanno occasionali "cracking" della matrice cristallino di miofilamenti. Fibre da adulti 1-settimana-vecchio Visualizza più grave cracking e sfilacciato miofibrille con qualche interruzione del reticolo miofilamenti. In mosche 2-giorno-vecchio rispetto al wild-type controlli, con nessuna mobilità ascendente ma qualche volo orizzontale viene ridotta capacità di volo. Negli adulti 1-settimana-vecchio, la capacità di volo è perso. Così, miosina alterata funzione permette montaggio Miofibrilla, ma i risultati in un disturbo progressivo della capacità di volo e della grata miofilamenti. Concludiamo che R759 nel dominio della miosina converter è essenziale per la normale attività dell'ATPasi, motilità in vitro e locomozione. I nostri risultati forniscono la prima prova mutazionale che segnalazione intramolecolare tra il dominio di inoltro loop e convertitore è critico per la funzione della miosina sia in vitro che nel muscolo.

Drosofila UNC-45 Impedisce L'aggregazione Indotta Dal Calore Della Miosina Del Muscolo Scheletrico E Facilita Il Ripiegamento Della Citrato Sintasi

Biochemical and Biophysical Research Communications. May, 2010  |  Pubmed ID: 20403336

UNC-45 appartiene alla famiglia di proteine dominio UCS (UNC-45, CRO1, She4p), i cui membri interagiscono con varie classi di miosina. Qui forniamo strutturali e prove biochimiche che Escherichia coli-espresso della drosofila UNC-45 (DUNC-45) mantiene l'integrità di diversi substrati durante lo stress termico-indotti in vitro. DUNC-45 schermi accompagnatore funzione nel sopprimere l'aggregazione del frammento muscolare miosina pesante meromyosin, il dominio motore miosina S-1, alfa-lattoalbumina e citrato sintasi. Prove biochimiche sono supportata da microscopia elettronica, che rivela le prime prove strutturali che DUNC-45 impedisce inter - o intra - molecular inerti di meromyosin pesanti muscoli scheletrici causata da temperature elevate. Abbiamo anche dimostrare per la prima volta che UNC-45 è in grado di ripiegare un substrato denaturato, urea-spiegato citrato sintasi. Nel complesso, questo studio in vitro fornisce la comprensione nel destino della miosina del muscolo in condizioni di stress e suggerisce che UNC-45 protegge e mantiene la macchina contrattile durante lo stress in vivo.

Drosofila UNC-45 Si Accumula Nel Blastoderma Embrionale E Nei Muscoli Ed è Essenziale Per La Stabilità Della Miosina Muscolare

Journal of Cell Science. Mar, 2011  |  Pubmed ID: 21285246

UNC-45 è un tuttofare che facilita la piegatura dei domini motore miosina. Abbiamo usato melanogaster della drosofila per indagare il ruolo di UNC-45 in funzione e lo sviluppo muscolare. Drosofila UNC-45 (dUNC-45) è espressa in tutte le fasi dello sviluppo. Colocalizza con miosina non-muscolare in embrionale germinativo di embrioni 2-ora-vecchio. Alle ore 14, si accumula più fortemente embrionale dei muscoli striati, analogamente alla miosina del muscolo. dUNC-45 si localizza a Z-dischi di sarcomeri nel terzi dei muscoli del corpo-parete larvale instar. Abbiamo prodotto un mutante dunc-45 in cui viene interrotta l'espressione zygotic. Il risultato è quasi impercettibili dUNC-45 livelli in maturazione di embrioni, come pure la letalità embrionale tardiva. Muscolare miosina accumulo è robusto negli embrioni mutanti dunc-45 alle ore 14. Tuttavia, miosina è drasticamente diminuita dei muscoli della parete del corpo di embrioni mutanti 22-ora-vecchio. Inoltre, la microscopia elettronica ha mostrato solo pochi filamenti spessi e irregolari spesso-sottile filamento reticolo spaziatura. La letalità, accumulo di proteina difettosa e ultrastrutturali sono salvati con un transgene dunc-45 wild-type, che indica che i fenotipi mutanti nascono dalla carenza di dUNC-45. Nel complesso, i nostri dati indicano che dUNC-45 è importante per la funzione di accumulo e muscolare miosina. Inoltre, i nostri risultati suggeriscono che dUNC-45 traduzionali agisce per la miosina corretta piegatura e maturazione.

Struttura Di Cristallo Dei Raggi X Dell'UCS Dominio Contenenti UNC-45 Miosina Chaperone Da Drosophila Melanogaster

Structure (London, England : 1993). Mar, 2011  |  Pubmed ID: 21397190

Le proteine di UCS, quali UNC-45, influenzano la contrazione muscolare e altri processi motili miosina-dipendente. Riportiamo la prima struttura di cristallo dei raggi x di una proteina dominio contenenti UCS, il tuttofare di miosina UNC-45 da Drosophila melanogaster (DmUNC-45). La struttura rivela che la centrale e l'UCS domini formano una disposizione contigua di 17 strati consecutivi di elicoidale che si organizzano in cinque armadillo discreta ripetizione sottodomini. Dati di Small-angle x-ray scattering suggeriscono che libero DmUNC-45 adotta una conformazione allungata e presenta la flessibilità nella soluzione. Sensibilità di proteasi esegue il mapping a un ciclo conservato che i contatti più carbossi-terminale UNC-45 armadillo ripetizione sottodominio. Conservazione degli aminoacidi attraverso diverse mappe di proteine UCS a una faccia di questo sottodominio carbossi-terminale e la maggior parte delle mutazioni che influenzano l'attività cellulare dipendente dalla miosina bugia all'interno o intorno a questa regione. Le nostre analisi cristallografiche, biofisiche e biochimiche suggeriscono che la funzione DmUNC-45 è garantita per la sua flessibilità e di integrità strutturale del suo dominio UCS.

Un Cuore Possente Piccolo: Il Proteoma Cardiaco Dell'adulto Drosophila Melanogaster

PloS One. 2011  |  Pubmed ID: 21541028

Melanogaster della drosofila sta emergendo come un sistema potente modello per lo studio delle malattie cardiache. Creazione di mappe di peptidi e proteine del cuore della drosofila è centrale alla realizzazione di studi di rete di proteine che ci permetterà di valutare i tratti distintivi della patogenesi del cuore della drosofila e misurare il grado di conservazione con meccanismi di malattia umana a livello di sistemi. Utilizzando un approccio di gel-LC-MS/MS, abbiamo individuato cluster proteina 1228 da 145 dissecate cuori adulti volare. Contrattile, cytostructural e proteine mitocondriali erano più abbondanti coerente con microscopio del tubo cardiaco della drosofila. Analisi funzionale/Ontological arricchimento ulteriormente ha mostrato che le proteine coinvolte nella glicolisi, associazione Ca(2+), redox e G-proteina di segnalazione, tra altri processi, inoltre sono sovrarappresentate. Confronto con un mouse cuore proteome rivelato conservazione a livello di funzione molecolare, i processi biologici e componenti cellulari. Il peptidome sussistere comprendeva 5169 distinti peptidi associati al cuore, di cui 1293 (25%) non era stato identificato in un recente compendio del peptide della drosofila. PeptideClassifier analisi ulteriormente è stato utilizzato per mappare i peptidi a gene-modelli specifici. 1872 peptidi forniscono preziose informazioni sui gruppi di isoforma proteica mentre un ulteriore 3112 univocamente identificare isoforme della proteina specifica e può essere utilizzato come una risorsa del peptide associato al cuore per proteomic quantitativa approcci basati sul monitoraggio multiplo-reazione. In sintesi, l'identificazione dei punti di eccitazione-contrazione della proteina riferimento orthologues di proteine associate a difetti cardiovascolari e conservazione delle ontologie di proteine, fornisce testimonianza per il cuore-come il carattere del tubo cardiaco della drosofila e l'utilità della proteomica come un complemento al potere della genetica in questo modello di crescita della malattia di cuore umano.

Due Mutanti Trasduttore Di Miosina Di Drosophila Con Cardiomiopatie Distinti Hanno ADP Divergenti E Affinità Di Actina

The Journal of Biological Chemistry. Aug, 2011  |  Pubmed ID: 21680742

Miosina Drosofila due II punto mutazioni (D45 e Mhc(5)) generare fenotipi cardiaci Drosophila che sono simili a cardiomiopatie umane restrittive o dilatate. Nostri modelli di omologia suggeriscono che le mutazioni (A261T in D45, G200D in Mhc(5)) potrebbe stabilizzare (D45) o destabilizzare (Mhc(5)) ciclo 1 di miosina, una regione conosciuta per influenzare il rilascio di ADP. Per guadagnare la comprensione del meccanismo molecolare che provoca il cardiomyopathic fenotipi di sviluppare, abbiamo determinato se la proprietà cinetica delle molecole mutanti sono state alterate. Abbiamo utilizzato subfragment miosina 1 (S1) che trasportano sia delle due mutazioni (S1(A261T) e S1(G200D)) dai muscoli di volo indiretto della drosofila. I dati cinetici mostrano che le due mutazioni puntiformi hanno un effetto opposto sull'attività enzimatica di S1. S1(A261T) è meno attivo (ridotto dell'ATPasi, maggiore affinità di ADP per S1 e actomiosina subfragment 1 (actina · S1) e ridotto la dissociazione indotta da ATP di actina · S1), mentre S1(G200D) indica aumentata attività enzimatica (ATPasi migliorata, ridotta affinità di ADP per S1 sia actina · S1). I cambiamenti nelle proprietà della miosina opposti sono coerenti con i fenotipi cardiaci indotti per S1(A261T) (dilatato) e S1(G200D) (restrittive). I nostri risultati forniscono approfondimenti romanzo i meccanismi molecolari che causano fenotipi differenti cardiomiopatia per questi mutanti. Inoltre, segnaliamo che S1(A261T) indebolisce l'affinità della S1 · ADP per actina, considerando che S1(G200D) aumenta. Questo può spiegare la soppressione (A261T) o miglioramento (G200D) del fenotipo hypercontraction muscolo scheletrico indotta dalla troponina I held-up(2) mutazione in drosofila.

Il Chaperone UNC-45 è Fondamentale Per Stabilire La Miosina-based Organization Miofibrillare E Contrattilità Cardiaca Nel Modello a Cuore Della Drosofila

PloS One. 2011  |  Pubmed ID: 21799905

UNC-45 è un accompagnatore di classe UCS (UNC-45/CRO1/She4P) necessarie per la miosina pieghevole e/o accumulo, ma il suo requisito per il mantenimento della contrattilità cardiaca non è stata esplorata. Data la prevalenza di mutazioni di miosina nel suscitare la cardiomiopatia, accompagnatori come UNC-45 sono suscettibili di essere altrettanto critico nella provocazione o modulante miosina associata cardiomiopatia. Qui, abbiamo utilizzato il modello di cuore di drosofila per esaminare il suo ruolo nella fisiologia cardiaca, in collaborazione con RNAi-mediata del gene silencing specificamente nel cuore in vivo. Analisi della fisiologia cardiaca è stata condotta utilizzando video ad alta velocità di registrazione in collaborazione con algoritmi di analisi del movimento. UNC-45 atterramento provocato gravemente compromessa funzione cardiaca in adulti come evidenziato da prolungati intervalli di pressione sistolici e diastolici e l'aumento dell'incidenza di aritmie e dilatazione estrema; quest'ultimo è stato accompagnato da una significativa riduzione nella contrattilità muscolare. Analisi strutturale ha mostrato ridotta miofibrille, disarray miofibrillare e notevolmente diminuito accumulo di miosina cardiaca. Cardiaco unc-45 tacere anche drasticamente ridotta durata di vita. Al contrario, terzo instar larvale e giovani cuori pupa ha mostrato lievi anomalie cardiache, come gravi difetti cardiaci solo sviluppati durante la metamorfosi. Inoltre, cardiaco unc-45 silenziamento nel cuore adulto (dopo la metamorfosi) portato a fenotipi meno gravi. Questo suggerisce che UNC-45 è principalmente richiesto per miosina accumulo/pieghevole durante il rimodellamento del cuore adulto formano. I difetti cardiaci, deficit di miosina e durata diminuita in mosche su atterramento di unc-45 specifico del cuore sono stati significativamente salvati da sovraespressione UNC-45. I nostri risultati sono il primo a dimostrare un requisito specifico di un accompagnatore in drosofila, suggestiva di un ruolo critico di UNC-45 in cardiomiopatie, compresi quelli associati con proteine dispiegate nel cuore dell'uomo guasto. Il fenotipo della cardiomiopatia dilatativa associato a deficit di UNC-45 è imitato da atterramento di miosina suggerendo che UNC-45 gioca un ruolo fondamentale nella stabilizzazione della miosina e possibilmente prevenire cardiomiopatie umani associato a carenze funzionali della miosina.

Perturbare L'interfaccia Convertitore-relay Miosina Altera La Prestazione Muscolare in Drosofila Volo Indiretto

Biophysical Journal. Sep, 2011  |  Pubmed ID: 21889448

Interazioni strutturali tra il convertitore di miosina e domini di inoltro sono state proposte per essere critico per la generazione della potenza ictus e muscolo del potere di miosina. Abbiamo testato questa ipotesi da mutazione di residui convertitore 759, che interagisce con residui di relè I508, N509 e D511, al glutammato (R759E) e determinato l'effetto sulle prestazioni meccaniche della drosofila indiretta volo muscolare. Analisi del ciclo di lavoro del mutante R759E volo indiretto fibre muscolari ha rivelato una riduzione del 58% e del 31% nella generazione di potenza massima (P(WL)) e la frequenza alla quale massima potenza (f(WL)) è generato, rispettivamente, rispetto alle fibre di controllo a 15 ° C. Piccola ampiezza sinusoidale analisi hanno rivelato un 30%, 36% e 32% di riduzione nel mutante modulo elastico, modulo viscoso e meccanica tasso costante 2πb, rispettivamente. Da questi risultati, noi dedurre che la mutazione riduce i tassi di transizioni attraverso gli Stati cross-bridge lavoro-produttori e/o generazione di forza durante gli stati fortemente legati. In uscita le riduzioni di potenza muscolare, rigidità e cinetica erano fisiologicamente rilevanti, come mutante ala battere frequenza e indice di volo è diminuito di circa il 10% e il 45% rispetto al controllo mosche sia 15 ° C e 25 ° C. Così, le interazioni tra il dominio di loop e convertitore di relè sono critiche per braccio di leva e coordinamento dominio catalitico, generazione di energia muscolare ad alta e ottime prestazioni di volo di Drosophila.

Base Strutturale Per Miopatici Difetti Generati Da Alterazioni Dell'asta Di Miosina

Journal of Molecular Biology. Dec, 2011  |  Pubmed ID: 22037585

Mentre mutazioni nel dominio della miosina subfragment 1 motore direttamente possono disturbare la generazione e trasmissione di forza lungo miofibrille e piombo alla miopatia, il meccanismo per cui mutazioni in asta miosina influenze funzione meccanica è meno chiaro. Qui, abbiamo utilizzato una combinazione di varie tecniche di imaging e simulazioni di dinamica molecolare per testare l'ipotesi che perturbazioni nell'asta della miosina possono disturbare il normale sarcomero uniformità e, come dominio motore lesioni, avrebbero influenzato la forza di produzione e propagazione. Mostriamo che perturbano l'asta può alterare le proprietà nanomeccanici e, in vivo, può guidare formazione asimmetrica miofilamenti e il sarcomero. I nostri risultati imaging indicano che mutazioni di rod miosina probabile disturbano la produzione e/o propagazione della forza contrattile. Questo fornisce una teoria unificante dove cascate patologiche comune accompagnano sia motore miosina e mutazioni di dominio specifico rod. Infine, consigliamo di tale disomogeneità sarcomero, causata da filamenti spessi asimmetriche, potrebbe essere un utile indice di disfunzione miopatiche.

Espressione Transgenica E Purificazione Delle Isoforme Di Miosina Utilizzando Il Sistema Muscolare Della Drosofila Melanogaster Voli Indiretti

Methods (San Diego, Calif.). Dec, 2011  |  Pubmed ID: 22178692

Gli studi biofisici e strutturali sulla miosina muscolare si basano su quantità milligrammi di materiale estremamente puro. Tuttavia, molte isoforme di miosina biologicamente interessanti sono espressi a livelli che sono troppo bassi per purificazione diretta da tessuti primari. Impegno volto a ricombinante espressione delle isoforme della miosina funzionale muscolo striato in batterica o coltura delle cellule dell'insetto in gran parte si sono incontrati con guasto, anche se espressione di alto livello nella coltura delle cellule muscolari è stato realizzato recentemente a spese significative. Segnaliamo un nuovo metodo per l'utilizzo di ceppi del moscerino della frutta Drosophila melanogaster geneticamente per la produzione di isoforme della miosina muscolare ricombinante istidina-etichettate. Questo metodo si avvale del gene di catena pesante della miosina singolo muscolo all'interno del genoma di Drosophila, l'alto livello di espressione della miosina accessibile nei muscoli toracici volo indiretto, la capacità di knock out espressione endogena di miosina in questo tessuto e il relativamente basso costo di manutenzione e produzione di Colonia di Mosca della frutta. Illustriamo questo metodo da esprimere e purificante una variante ricombinante di istidina-etichettate della miosina di muscolo scheletrico embrionale parete corporea II da un ceppo di vola ingegnerizzato. La proteina ricombinante è sufficiente purezza e omogeneità per cristallizzazione e mostra l'attività dell'ATPasi previsto. Questo sistema può rivelarsi utile per l'espressione e l'isolamento di mutanti myosins associate a malattie del muscolo scheletrico e cardiomiopatie per la loro caratterizzazione biochimica e strutturale.

Relè Alternativi E Convertitore Domini Tune Native Muscolare Miosina Isoform Funzione in Drosofila

Journal of Molecular Biology. Dec, 2011  |  Pubmed ID: 22226837

Isoforme della miosina consentono di definire proprietà contrattili e strutturali specifiche del muscolo. Splicing alternativo di trascrizioni di gene per le catene pesanti della miosina nel melanogaster della drosofila produce isoforme muscolo-specifici ed evidenzia domini alternativi che perfezionare la funzione della miosina. Per guadagnare la comprensione come miosina nativa è sintonizzata, abbiamo espresso tre isoforme di miosina embrionale nei muscoli indiretti volo privo di miosina endogena. Queste isoforme differiscono nei loro domini relè e/o convertitore. Abbiamo analizzato l'attività ATPasi isoform specifico, Miofibrilla struttura/stabilità e motilità actina in vitro. Troviamo che miosina del muscolo dorsale acuto parete corporea (EMB-9c11d) Mostra un aumento significativo di FV MgATPase e actina scorrevole Velocità, così come Assemblea Miofibrilla anomala rispetto al miosina della cardioblast (EMB-11 d). Queste proprietà differiscono a causa di domini alternativi relè con esone 9-codifica che sono ipotizzati per comunicare i segnali tra la tasca ATP-binding, sito di legame dell'actina e il dominio del convertitore. Ulteriormente, EMB-11 d spettacoli significativamente ridotto i livelli di Ca - basale e MgATPase così come MgATPase FV rispetto alla parete del corpo embrionale muscolare isoform (EMB) (espressi in una moltitudine di muscoli della parete di corpo). EMB-11 d inoltre induce actina aumento velocità di strisciamento e stabilizza la struttura Miofibrilla rispetto all'EMB. Queste differenze derivano da domini convertitore alternativo esone 11-codificati che vengono proposti per riposizionare il braccio di leva durante i tratti di alimentazione e recupero. Concludiamo che relè e convertitore domini delle isoforme di miosina nativo ottimizzare attività ATPasi, motilità actina e ultrastruttura del muscolo. Questa verifica e si estende precedenti studi con molecole chimeric e indica che le interazioni dei relè e convertitore durante il ciclo contrattile sono la chiave per funzioni specifiche di miosina-isoforma cinetiche e meccaniche.

Misurazione Passiva Rigidità Miocardica in Drosophila Melanogaster Per Indagare La Disfunzione Diastolica

Journal of Cellular and Molecular Medicine. Jan, 2012  |  Pubmed ID: 22225769

Invecchiamento è caratterizzato da un declino nella funzione diastolica ventricolare sinistra, che comprende anomalie nel rilassamento diastolico, riempimento di camera e/o passiva rigidità del miocardio. Genetica trattabilità e breve vita span marca Drosophila melanogaster un organismo ideale per studiare gli effetti dell'invecchiamento sulla funzione cardiaca, compresi senescenti associati cambiamenti nell'espressione genica e nella rigidità del miocardio passiva. Tuttavia, uso del tubo della drosofila cuore per sondare il deterioramento delle prestazioni diastolica è soggetto almeno due sfide: la misura di omologia genetica ai mammiferi e la capacità di risolvere le proprietà meccaniche del bilayered cuore volo, che consiste di uno strato muscolare ventrale che copre i cardiomiociti contrattile. Qui ci sostengono per l'uso diffuso di Drosophila come modello di invecchiamento del miocardio romanzo 1) che descrive la disfunzione diastolica in mosche, 2) discutendo come critical pathways coinvolti nella disfunzione sono conservate in tutta la specie, e 3) dimostrando il vantaggio di un metodo di analisi basata sulla microscopia forza atomica per misurare la rigidità del tubo multistrato drosofila cuore versus miociti isolati da altri sistemi di modello. Utilizzando potenti strumenti genetici della drosofila puntiamo ad alterare in modo efficiente cambiamenti osservati in fattori che contribuiscono alla disfunzione diastolica per capire come si potrebbero migliorare le prestazioni diastolica all'età avanzata negli esseri umani. © 2011 Autori Journal of Cellular and Molecular Medicine © 2011 Fondazione per cellulare e molecolare medicina/Blackwell Publishing Ltd.