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Articles by Santosha Vardhana in JoVE
JoVE General
Soutenu bicouches planaires pour la formation des synapses immunologiques Etude de et Kinapse
Soutenu bicouches planaires sont des outils puissants qui peuvent être utilisés pour modéliser les interactions moléculaires dans une synapse immunologique. Ici, nous montrons des méthodes pour l'ancrage des protéines d'adhésion cellulaire connue pour moduler la formation des synapses au feuillet supérieur de la bilyer lipides et de visualiser la formation des synapses en microscopie TIRF.
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T Cell-dendritiques Synapses Immunologiques Cellulaires Contiennent Des TCR-dépendants CD28-CD80 Clusters Qui Recrutent La Protéine Kinase C Thêta
Courte durée de vie microamas TCR et une protéine kinase de plus longue durée Ctheta-mise au point central du cluster d'activation supramoléculaire (cSMAC) ont été définis au niveau des synapses immunologiques modèle (IS). Dans les systèmes de différents modèles, les interactions de co-stimulation CD28 à médiation ont été détectés dans microamas, le cSMAC, ou séparés de la TCR formant de multiples foyers distincts. La relation entre TCR et les molécules co-stimulatrices dans le physiologique est de lymphocytes T-cellules dendritiques (DC) est obscure. Pour étudier la relation dynamique de CD28-CD80 et les interactions TCR dans la cellule T-DC est au cours de l'Ag-activation des lymphocytes T spécifiques, nous avons généré des souris CD80-ECFP utilisant la technologie bactérienne chromosome artificiel transgénique. Dans les pays développés spléniques, endogène CD80 et CD80-ECFP localisée à la membrane plasmique et appareil de Golgi, et CD80-ECFP était fonctionnelle in vivo. Dans le T OT-II cellule-DC est, multiple distincts TCR, CD80, et LFA-1 foyers ont été détectés. Dans le lymphocyte T-DC synapse grappes CD80 sont colocalisés avec CD28 et PKCtheta, une caractéristique de l'cSMAC. Blocus aiguë des TCR de signalisation anti-MHC Ab a entraîné une réduction rapide de la Ca (2 +) de signalisation et le nombre et la taille des clusters du CD80, une caractéristique de TCR microamas. Ainsi, la cellule T-DC interface contient des foyers de costimulation dynamique qui partagent des caractéristiques de microamas et cSMACs.
La Classe II Phosphatidylinositol 3 Kinase C2beta Est Requise Pour L'activation Des Canaux K + KCa3.1 Et Lymphocytes T CD4
Le Ca (2 +)-actif K (+) du canal KCa3.1 est nécessaire pour le Ca (2 +) afflux et l'activation subséquente des lymphocytes-T. On a montré que précédemment nucléoside diphosphate kinase bêta (NDPK-B), une histidine kinase de mammifère, phosphoryle et active directement KCa3.1 et est nécessaire pour l'activation de lymphocytes T CD4 humaine. Nous allons maintenant montrer que la classe II phosphatidylinositol 3-kinase C2beta (PI3K-C2beta) est activée par le récepteur des cellules T (TCR) et les fonctions en amont de NDPK-B pour activer KCa3.1 l'activité du canal. Diminution de l'expression de la PI3K-C2beta par siRNA en cellules CD4 des cellules T humaines a entraîné une inhibition de l'activité du canal KCa3.1. L'inhibition était due à une diminution de phosphatidylinositol 3-phosphate [PI (3) P] parce dialyse PI3K-C2beta siARN-traité les cellules T avec PI (3) P sauvé KCa3.1 l'activité du canal. En outre, la surexpression de la PI3K-C2beta dans KCa3.1 transfectées Jurkat T-cellules conduit à une augmentation TCR stimulée par l'activation de KCa3.1 et Ca (2 +) afflux, tandis que taire de la PI3K-C2beta inhibé les deux réponses. Utilisation totale microscopie de fluorescence interne de réflexion et bicouches lipidiques planes, nous avons constaté que la voie PI3K-C2beta colocalisés avec ZAP70 et le TCR dans microamas périphériques dans la synapse immunologique. Il s'agit de la première démonstration qu'une classe II PI3K joue un rôle essentiel dans l'activation des lymphocytes T-.
Rôle Essentiel De La Protéine Ubiquitine Et TSG101 Dans La Formation Et La Fonction Du Cluster D'activation Supramoléculaire Centrale
Agonistes complexes CMH-peptide de la synapse immunologique (IS) par le biais du signal de récepteur de cellule T (TCR) microamas (MC) qui convergent en un groupe d'activation supramoléculaire centrale (cSMAC). Les déterminants et les fonctions de la cSMAC restent inconnus. Nous démontrons un rôle essentiel pour l'ubiquitine (Ub) et TSG101, mais moins pour les HRS, à des événements de traitement du signal à la cSMAC. Utilisation de siRNA dans des cellules T primaires, nous montrons que la reconnaissance par Ub TSG101 est nécessaire à la formation cSMAC, la résiliation TCR signal MC, la régulation négative du TCR, et la ségrégation des TCR-CMH-peptide à partir de la PKC-theta enrichi de signalisation complexes. Faibles agonistes du CMH-peptide induites CD80-dépendants MC TCR que dissocié dans le centre de l'IS sans recruter TSG101. Ces résultats appuient TSG101-dépendante la reconnaissance de CD80-indépendante MCs TCR comme un point de contrôle moléculaire de la régulation à la baisse du TCR.
