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Articles by Santosha Vardhana in JoVE
JoVE General
Supportato bilayers Planar per la formazione degli Studi di sinapsi immunologica e Kinapse
Supportati doppi strati planari sono strumenti potenti che possono essere utilizzati per modellare le interazioni molecolari in una sinapsi immunologica. Qui vi mostriamo i metodi per l'ancoraggio delle proteine di adesione cellulare conosciuto per modulare la formazione di sinapsi il foglio superiore della bilyer lipidi e visualizzare formazione di sinapsi usando la microscopia TIRF.
Other articles by Santosha Vardhana on PubMed
Sinapsi Immunologica Delle Cellule Dendritiche Delle Cellule T Contengono TCR-dipendente CD28-CD80 Cluster Che Recluta Theta Di Proteina Chinasi C
Breve durata TCR microclusters e un balagh cluster centrale supramolecolare attivazione proteina chinasi Ctheta di messa a fuoco (cSMAC) sono stati definiti nelle sinapsi immunologica modello (IS). Nei sistemi di modello diverso, interazioni costimolazione CD28-mediata sono state rilevate in microclusters, cSMAC, o segregate da TCR formando molteplici focolai distinti. Il rapporto tra TCR e molecole di costimolazione è fisiologico della cellula T cellule dendritiche (DC) è oscuro. Per studiare il rapporto dinamico di CD28-CD80 e interazioni TCR nella cellula T-DC è durante l'attivazione della cellula T Ag-specifici, abbiamo generato CD80-eCFP topi utilizzando la tecnologia transgenica cromosoma artificiale batterico. DCs splenica, CD80 endogeni e CD80-eCFP localizzata al plasma, membrana e apparato del Golgi e CD80-eCFP era funzionale in vivo. In OT-II T cell-DC è, sono stati rilevati più segregato cluster TCR, CD80 e LFA-1. Nella cellula T-DC cluster CD80 sinapsi sono stati colocalized con CD28 e PKCtheta, una caratteristica della cSMAC. Blocco acuto del TCR segnalazione con Ab anti-MHC ha provocato una rapida riduzione nella segnalazione Ca(2+) e il numero e la dimensione dei cluster CD80, una caratteristica del TCR microclusters. Così, l'interfaccia di cellule T-DC contiene foci di costimolazione dinamici che condividono caratteristiche di microclusters e cSMACs.
La Chinasi Del Fosfatidilinositolo 3 II Classe C2beta è Richiesto Per L'attivazione Del Canale K + KCa3.1 E Cellule T CD4
Il canale attivato Ca(2+) K(+) KCa3.1 è necessario per Ca(2+) afflusso e la successiva attivazione delle cellule T. Abbiamo dimostrato in precedenza che beta di chinasi del difosfato di nucleoside (NDPK-B), una chinasi istidina mammiferi, direttamente fosforila e attiva KCa3.1 ed è necessaria per l'attivazione dei linfociti T CD4 umani. Mostriamo ora che la chinasi di fosfatidilinositolo 3 II classe C2beta (PI3K-C2beta) è attivato dal recettore delle cellule T (TCR) e funzioni a Monte di NDPK-B per attivare KCa3.1 canale attività. Diminuita espressione di PI3K-C2beta di siRNA in CD4 T-cellule umane ha provocato l'inibizione dell'attività del canale KCa3.1. L'inibizione è stato a causa della diminuita fosfatidilinositolo-3-fosfato [PI (3) P] perché dialyzing PI3K-C2beta trattati con siRNA T-cellule con PI (3) P salvato attività del canale KCa3.1. Inoltre, sovraespressione di PI3K-C2beta in KCa3.1-transfected Jurkat T-cellule ha portato alla maggiore attivazione TCR-stimolato di afflusso KCa3.1 e Ca(2+), considerando che il silenziamento di PI3K-C2beta inibito entrambe le risposte. Utilizzando la microscopia di fluorescenza di riflessione interna totale e lipidici planare, abbiamo trovato che PI3K-C2beta colocalized con Zap70 e il TCR in microclusters periferico in sinapsi immunologica. Questa è la prima dimostrazione che una classe II PI3K svolge un ruolo critico nell'attivazione delle cellule T.
Ruolo Essenziale Dell'ubiquitina E Proteina TSG101 Nella Formazione E Nella Funzione Del Cluster Centrale Attivazione Supramolecolare
Complessi MHC-peptide agonista in sinapsi immunologica (IS) il segnale attraverso T cell receptor (TCR) microclusters (MCs) che convergono in un cluster di attivazione supramolecolare centrale (cSMAC). Le determinanti e la funzione della cSMAC rimangono sconosciute. Dimostriamo un ruolo essenziale per il ubiquitin (Ub) e TSG101, ma di meno così per ore, in segnale elaborazione eventi presso la cSMAC. Utilizzando siRNA in cellule T primarie, mostriamo che Ub riconoscimento da parte di TSG101 è necessario per la formazione cSMAC, terminazione del segnale TCR MC, TCR downregulation e segregazione del TCR-MHC-peptide da PKC theta-arricchita di complessi di segnalazione. Debole agonista MHC-peptide indotta da MCs TCR CD80-dipendente che dissociato nel centro della è senza TSG101 di reclutamento. Questi risultati supportano il riconoscimento TSG101-dipendente di MCs TCR CD80-indipendente come un checkpoint molecolare per TCR downregulation.
