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Articles by Sascha Gille in JoVE
JoVE General
Oligo Messe Profiling (OLIMP) der extrazellulären Polysacchariden
1Energy Biosciences Institute, University of California, Berkeley, 2Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley
Eine schnelle Art und Weise beschrieben, Einblicke in die Struktur der Polysaccharide in einer extrazellulären Matrix zu gewinnen. Die Methode nutzt die Spezifität von Glykosylhydrolasen und die Empfindlichkeit der Massenspektrometrie ermöglicht winzige Mengen von Materialien analysiert werden. Diese Technik ist anpassungsfähig, um direkt auf das Gewebe selbst verwendet werden.
Other articles by Sascha Gille on PubMed
Zweistufiger Echtzeit-PCR-Quantifizierung Der Alle Untertypen Des Humanen Immundefizienz-Virus Typ 1 Durch Eine Interne Methode, Die Mit Gesperrte Nukleinsäure-basierten Sonden
Aktuelle HIV-1 Viruslast Assays sind zu teuer und zeitraubend für kleine Probemenge oder beschränkten Ressourcen-Einstellung. Darüber hinaus haben einige kommerziellen Proben Mängel gezeigt, Quantifizierung seltene Genotypen. Wir entwickelt eine intern kontrolliert, zweistufigen, reverse Transkription initiierte Echtzeit-PCR-Protokoll auf dem LightCycler-Instrument erreichen eine günstige Nachweisgrenze mit einem erweiterten Quantifizierung, erkennen alle HIV-1 Subtypen für Labors mit niedrigen Probendurchsatz geeignet. Die Nachweisgrenze wurde festgestellt, dass 100 Kopien/ml aufweisen, der Dynamikbereich bis 500.000.000 Kopien / ml. Intra und inter-Assay Ungenauigkeit waren 1,6 % und 2,0 % (n = 10), beziehungsweise. Die Probe wurde gegen WHO-Norm 97/656 kalibriert. Die HIV-1 RNA-Werte, die durch Echtzeit-PCR-Assay wurden mit denjenigen von den Cobas Amplicor HIV-1 Monitor hoch korreliert (R = 0.954; p < 0,001). Dieses Rapid (3 Std.) und kostengünstige Assay eignet sich für HIV-1-Erkennung und Seuchenüberwachung mit der Fähigkeit zur Erkennung und Quantifizierung alle HIV-1 Subtypen einschließlich O1 und O2.
Kennung Der Pflanzlichen Zellwand Mutanten Durch Ein Forward Chemische Genetischer Ansatz Mit Hydrolases
Ein bisher unbeschriebene forward chemischer-genetischer-Bildschirm mit Hydrolases Auswirkungen auf die extrazelluläre Matrix wird eingeführt. Der entwickelte Bildschirm nutzt die Macht der chemische Genetik und kombiniert sie mit den bekannten Substratspezifität der Glycosylhydrolases, was bei der Auswahl der bedingten Mutanten, die strukturellen Mängel in ihrer extrazellulären Matrix aufweisen. Identifizierung der Verantwortlichen genetischen Locus in diesen Mutanten erweitert deutlich unser Wissen von Genen, die in die Biosynthese, Stoffwechsel, Signalisierung und Funktionalität der Komponenten der extrazellulären Matrix. Durch einen Schirm der mutagenized Arabidopsis-Pflanzen ausgesetzt Wachstum in flüssiger Kultur in Anwesenheit eines Xyloglucanase, ein Enzym in der großen Strahlenvernetzung Glykan handelnde in der extrazellulären Matrix dieser Pflanze gefunden, wird die Methode veranschaulicht. Mittels dieser Bildschirm Hydrolase-basierten, wurden Dutzende von pflanzlichen Zellwand Mutanten (Xeg Mutanten) identifiziert, führt zur Identifizierung der 23 genetische Loci, die Zellwände von Pflanzen zu beeinflussen. Ist eines der identifizierten Loci XEG113, Codierung einer Familie 77 Glycosyltransferase (GT77). Detaillierte Analyse der Mauer von dieser Mutant erklärt, dass seine Extensins, vorhanden in Wänden, strukturelle Glyocoproteins sind Underarabinosylated. Xeg-113 Pflanzen zeigen mehr länglichen Hypocotyls als WT, den genetischen Nachweis, die O-Glykosylierung--konkret plant Extensin Arabinosylation--für Zelle Dehnung wichtig ist.
Gleichzeitige Quantifizierung Und Genotypisierung Von Hepatitis C-Virus-RNA Durch Einen Zweistufigen Echtzeit-PCR-assay Auf Dem Lightcycler-Instrument
Klinisch, Viruslast und Genotypen werden wichtige Prädiktoren für antivirale Therapie Ergebnis hinsichtlich chronischer Hepatitis C gefunden worden, und sie sind, unter normalen Umständen als separate Proben durchgeführt.
Loss of Function Mutation Des Reduziert Wand ACETYLATION2 in Arabidopsis Führt Zu Reduzierten Zellwand Acetylierung Und Erhöhte Resistenz Gegen Botrytis Cinerea
Fast alle Polysaccharide in pflanzlichen Zellwände sind O-acetylierte, einschließlich der verschiedenen pectic Polysaccharide und Hemicelluloses Xylane, Mannan und Xyloglucan. Die Enzyme der Polysaccharid-Acetylierung beteiligt wurden jedoch nicht festgestellt. Während die Rolle der Polysaccharid-Acetylierung in-vivo unklar ist, ist bekannt, Biokraftstoff-Ausbeute von Lignocellulose zu reduzieren durch die Hemmung der Mikroorganismen zur Gärung. Wir haben vier Arabidopsis (Arabidopsis Thaliana) UCP1 des Proteins Cas1p bekanntermaßen Polysaccharid O-Acetylierung in Cryptococcus Neoformans beteiligt werden analysiert. Verlust der Funktion Mutanten in einem der Gene, benannten reduziert Wand ACETYLATION2 (RWA2), die Ebenen der acetylierten Zellwand Polymere abgenommen hatte. Zellwand Material isoliert von mutierten Blätter und mit Alkali behandelt veröffentlicht etwa 20 % geringere Beträge Essigsäure gegenüber dem Wildtyp. Das gleiche Maß an Acetat-Mangel wurde in mehreren pectic Polymere und Xyloglucan gefunden. So beeinflussen die rwa2 Mutationen verschiedene Polymere in gleichem Maße. Es gab keine offensichtliche Wachstum oder morphologischen Unterschiede zwischen den Wildtyp und Mutanten rwa2 beobachtet. Jedoch angezeigt beide Allele des rwa2 erhöhte Toleranz gegenüber den Necrotrophic pilzartige Erreger Botrytis Cinerea.
Ultratiefe Sequenzierung Von Voodoo Lilie (Amorphophallus Konjac): Ein Ansatz Zur Identifizierung Von Relevante Genen Bei Der Synthese Von Der Polyose Glucomannan
Eine Roche 454 cDNA Ultratiefe Sequenzierung Experiment wurde auf eine entwickelnde Knolle Amorphophallus Konjac--auch Voodoo Lilie durchgeführt. Das dominierende Speicher-Polymer in die Knolle dieser Pflanze ist das Polysaccharid Glucomannan, ein Polyose bekannt, dass in den Cell walls höherer Pflanzen und ein Hauptbestandteil der pflanzlichen Biomasse aus Nadelholz abgeleitet. Sie bekam insgesamt 246 Mega-Basenpaare von Sequenzdaten aus dem 4.513 unterschiedlichen Contigs versammelt waren. Innerhalb dieser Voodoo Lilie ausgedrückt-Sequence-Tag-Auflistung wurden Gene, die verwandte Kohlenhydrat-Pathway Glucomannan Biosynthese darstellt identifiziert, einschließlich Saccharose-Metabolismus, Nukleotid Zucker Konvertierung Wege für die Bildung von aktivierten Vorprodukten sowie ein mutmaßliches Glucomannan-Synthase. In-vivo Ausdruck der vermeintlichen Glucomannan-Synthase und nachfolgende in-vitro-Aktivität Proben eindeutig nachweisen, dass das Enzym in der Tat Glucomannan-kodiert und Glucosyl-Transferase-Aktivitäten hat. Basierend auf den zum Ausdruck gebrachten Sequenzanalyse Tag bisher unbekannte Wege für die Synthese von BIP-Glukose, eine notwendige Vorstufe für Glucomannan-Biosynthese, könnte vorgeschlagen werden. Darüber hinaus unterstreichen die Ergebnisse transkriptionelle Engpässe für die Synthese von diesem Polyose.
O-HbA1c Zellwand Proteine Sind Wichtig Bei Root Haarwuchs
Wurzelhaare sind einzelne Zellen, die durch Spitze Wachstum entwickeln und sind spezialisiert auf die Absorption von Nährstoffen. Ihre Zellwände bestehen aus Polysacchariden und Hydroxyprolin-reiche Glykoproteine (HRGPs), die Extensins (EXTs) und Arabinogalactan-Proteine (AGPs) enthalten. Hydroxylierung von Prolin, eine frühe posttranslationale Modifikation der HRGPs, die durch Prolyl 4-Tryptophanhydroxylase (P4Hs), katalysiert wird definiert die nachfolgenden O-Glykosylierung Sites in EXTs (die hauptsächlich Arabinosylated) und AGPs (die vor allem Arabinogalactosylated). Wir untersuchten die biologische Funktion von P4Hs, Arabinosyltransferases und EXTs in Root Haar Zellwachstum. Biochemische Hemmung oder genetische Störung führte zu der Blockade des polarisierten Zunahme der Wurzelhaare und reduziert Arabinosylation von EXTs. Unsere Ergebnisse zeigen das richtig, dass O-Glykosylierung auf EXTs unerlässlich ist, für die Zellwand Selbstmontage und somit root Haar Dehnung in Arabidopsis Thaliana.
Sezieren Die Rolle Des CHITINASE-LIKE1 in Nitrat-abhängige Änderungen in Der Stamm-Architektur
Der Stamm-Phänotyp von einer Mutante Arabidopsis (Arabidopsis Thaliana), der CHITINASE-LIKE1 (CTL1), genannt Arm (für Anion-bezogene Stamm Morphologie), war zuvor gezeigt, Wachstum auf hohe Nitrat, Chlorid oder Saccharose abhängig sein. Mutanten unter restriktiven Bedingungen angezeigt Hemmung der primären Wurzelwachstum, radial gewachsen Schwellung, Verbreitung von seitlichen Wurzeln und Root Haar Dichte erhöht. Wir fanden hier, dass das räumliche Muster des CTL1 Ausdrucks vorwiegend im Stamm und Wurzel-Tipps während der Sämling-Entwicklung und das Protein in der Zellwand lokalisiert. Fourier-Transform-Infrarot-Mikrospektroskopie mutant Stamm Gewebe angegebenen Unterschiede in Spektren zugewiesen Zusammenhänge in Zellulose und Pektin. Tatsächlich gab der Zellwand Polymer Zusammensetzung Ursachenanalyse, dass der Arm-Mutant weniger kristalline Zellulose enthalten und Methylesterification von Pektinen reduziert. Wir untersuchten auch die Implikation der Wachstumsregler auf den Phänotyp der mutant Reaktion auf die Nitrat-Versorgung. Exogene Abscisic Säure Anwendung gehemmt mehr drastisch primäre Wurzelwachstum in der Arm-Mutant aber nicht unterdrücken, seitliche Verzweigung gegenüber dem Wildtyp. Cytokinine Ebenen lagen im Stamm Arm, aber es gab keine Änderungen in mitotische Aktivität, was darauf hindeutet, dass diese Cytokinine in der mutant Phänotyp nicht direkt beteiligt ist. Ethylen-Produktion war in Arm höher, aber umgekehrt proportional zu der Nitratkonzentration im Medium. Eto2 und eto3-Ethylen-Überproduktion-Mutanten nachgeahmt Interessanterweise einige bedingte Stamm Merkmale von den Arm-Mutanten auf hohe Nitrat. Unsere Daten empfehlen, dass Ethylen beteiligt sein kann, in der Arm-mutant-Phänotyp, wenn auch indirekt, anstatt als ein Primärsignal funktioniert.
O-Acetylierung Von Arabidopsis Polyose Xyloglucan Ist AXY4 Oder AXY4L, Proteine Mit Einer TBL Und DUF231-Domäne Erforderlich
In einem Arabidopsis Thaliana weiterleiten genetischen Bildschirm, die darauf abzielen, die Identifikation von Mutanten mit veränderten Strukturen der ihre Polyose Xyloglucan (axy Mutanten) mit Oligosaccharid-Masse, die Profilerstellung, zwei Nonallelic Mutanten (axy4-1 und axy4-2), die eine Ermäßigung von 20 bis 35 % an Xyloglucan O-Acetylierung wurden identifiziert haben. Zuordnung der Mutation im axy4-1 identifiziert AXY4, einen Typ II Transmembranprotein mit eine Trichome Doppelbrechung-wie auch eine Domäne der unbekannten Funktion (DUF231). Verlust der AXY4 Abschrift ergibt einen völligen Mangel an O-Acetyl-Substituenten auf Xyloglucan in verschiedenen Geweben, außer Samen. Samen Xyloglucan ist stattdessen durch die Paralog AXY4like, O-acetylierte wird durch die Analyse der entsprechenden T-DNA muss Linien demonstriert. Wand-Fraktionierung-Analyse der axy4-Knockout-Mutanten angedeutet, dass nur ein Bruchteil, Xyloglucan enthält nicht-O-acetylierte. Daher AXY4/AXY4L ist erforderlich, damit die O-Acetylierung des Xyloglucan und schlagen wir vor, dass diese Proteine Xyloglucan-spezifische O-Acetyltransferases, darstellen, obwohl ihre Spender und Akzeptor Substrate müssen noch festgelegt werden. Ein Arabidopsis-Ökotyp, Ty-0, Xyloglucan O-Acetylierung durch Mutationen im AXY4, zeigen, dass O-Acetylierung des Xyloglucan des Betriebes nicht beeinträchtigt Eignung in seiner natürlichen Umgebung reduziert hat. Die Beziehung der AXY4 mit einem anderen identifizierten zuvor Gruppe von Arabidopsis Proteine beteiligt im allgemeinen Wand O-Acetylierung, Wand-Acetylierung reduziert, werden diskutiert.
