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Articles by Scott Dewell in JoVE
JoVE General
PAR-Clip - un metodo per identificare trascrittoma livello i siti di legame delle proteine RNA binding
1Howard Hughes Medical Institute, Laboratory of RNA Molecular Biology, Rockefeller University, 2Berlin Institute for Medical Systems Biology, Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine, 3Biozentrum der Universität Basel and Swiss Institute of Bioinformatics (SIB), 4Biozentrum der Universität Basel and Swiss Institute of Bioinformatics (SIB), 5Genomics Resource Center, Rockefeller University
Trascrizioni di RNA sono soggetti ad ampie regolamentazione posttranscriptional che è mediato da una moltitudine di trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Qui vi presentiamo un metodo generalizzabile per identificare con precisione e trascrittoma su scala i siti di legame di RNA RBPs.
Other articles by Scott Dewell on PubMed
Sequenziamento Del Genoma Nei Reattori Ad Alta Densità Picolitre Microfabricated
La proliferazione di progetti di sequenziamento del DNA su larga scala negli ultimi anni ha spinto a cercare metodi alternativi per ridurre tempi e costi. Qui descriviamo un sistema scalabile e altamente parallelo sequenziamento con crudo throughput significativamente maggiore di quello di elettroforesi capillare dello stato-of-the-art strumenti. L'apparato utilizza un romanzo slide in fibra ottica dei singoli pozzi ed è in grado di 25 milioni di basi, al 99% o migliore accuratezza, in quattro una ore esecuzione di sequenza. Per ottenere un aumento di circa 100 volte in velocità effettiva sopra l'attuale tecnologia di sequenziamento di Sanger, abbiamo sviluppato un metodo di emulsione per l'amplificazione del DNA e uno strumento per il sequenziamento di sintesi utilizzando un protocollo pyrosequencing ottimizzato per supporto solido e volumi picolitre-scala. Qui mostriamo l'utilità, velocità effettiva, precisione e robustezza di questo sistema di sequenziamento shotgun e de novo assemblaggio del genoma Mycoplasma genitalium con copertura al 96% al 99.96% di precisione in una corsa della macchina.
Analisi E Sequenziamento Del Genoma Rivela Possibili Fattori Determinanti Del Carrello Nasale Di Staphylococcus Aureus
Carrello nasale di Staphylococcus aureus è un importante fattore di rischio clinico e impostazioni di comunità a causa della gamma di eziologie causata dall'organismo. Abbiamo individuato proprietà uniche ultrastrutturale e immunologica associata con carrello nasale isolati che denota un ruolo per i fattori batterici in carrozza nasale. Tuttavia, nonostante ampie caratterizzazioni livelli molecolare da diversi gruppi suggerendo i fattori necessari per la colonizzazione su epitelio nasale, determinanti genetici di trasporto nasale sono sconosciuti. Nel presente documento, abbiamo posto un fondamento genomic per disfare i determinanti batterici di trasporto nasale in S. aureus.
Quattro Varianti Dell'istone Segnano I Confini Delle Unità Di Trascrizione Policistronico in Trypanosoma Brucei
Insolitamente per un'eucariote, geni trascritti dalla RNA polimerasi II (pol II) in Trypanosoma brucei sono organizzati in unità di trascrizione policistronico. Con una sola eccezione, motivi di promotore pol II non sono state identificate, e come è iniziata la trascrizione resta un enigma. T. brucei ha quattro varianti dell'istone: H2AZ, H2BV, H3V e H4V. Usando immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) e sequenziamento (ChIP-seq) per esaminare il genome-wide distribuzione dei componenti della cromatina, mostriamo che gli istoni H4K10ac, H2AZ, H2BV e che il fattore BDF3 sono arricchiti fino a 300-fold presso siti (TSSs) di inizio della trascrizione del II probabile pol. Mostriamo anche che nucleosomes contenente H2AZ e H2BV sono meno stabili nucleosomes canonica. Identifica anche la nostra analisi > 60 candidati TSS e rivela la presenza di guanina lunga gira a probabile TSSs. apparentemente unico di tripanosomi, varianti supplementari dell'istone H3V e H4V sono arricchiti in siti di terminazione probabile pol II trascrizione inaspettato. I nostri risultati suggeriscono che le modifiche dell'istone e varianti dell'istone giocano un ruolo cruciale nell'iniziazione della trascrizione e terminazione in tripanosomi e quella destabilizzazione dei nucleosomi da varianti dell'istone è un meccanismo evolutivamente antico e generale di iniziazione della trascrizione, ha dimostrato in un organismo in cui fattori di trascrizione generali pol II sono stati evasivi.
Distinti Fattori Di Controllo Localizzazione Di H3.3 Variante Dell'istone a Specifiche Regioni Genomiche
L'incorporazione di varianti di istone H3 è stato implicato nella memoria epigenetica di stato cellulare. Utilizzando genoma editing con le nucleasi zinc-finger di tag H3.3 endogena, riportiamo genome-wide profili delle varianti H3 nei mammiferi le cellule staminali embrionali e cellule precursori neuronali. Genome-wide patterns of H3.3 dipendono dalla sequenza aminoacidica e cambiare con differenziazione cellulare a loci evolutivamente regolamentati. Il chaperone H3.3 Hira è necessario per l'arricchimento di H3.3 a geni attivi e represse. Sorprendentemente, Hira non è essenziale per la localizzazione di H3.3 presso telomeri e molti siti di legame del fattore di trascrizione. Purificazione di Immunoaffinity e spettrometria di massa rivelano che le proteine Atrx e Daxx associano con H3.3 in modo indipendente dal Hira. ATRX è necessaria per la localizzazione di Hira-indipendente di H3.3 presso telomeri e per la repressione del RNA telomerica. I nostri dati dimostrano che multipli e distinti fattori sono responsabili della localizzazione H3.3 a specifiche posizioni genomiche in cellule di mammifero.
Transcriptome Identificazione Dei Siti Di RNA-binding Protein E MicroRNA Bersaglio Da PAR-CLIP
Trascrizioni di RNA sono soggetti a regolazione genica posttranscriptional coinvolgendo centinaia di RNA-binding proteins (RBPs) e microRNA contenenti complessi ribonucleoproteina (miRNPs) espressi in modo dipendente dal tipo di cellula. Abbiamo sviluppato un approccio basato sulle celle reticolazione per determinare a livello transcriptome e ad alta risoluzione i siti di legame di RBPs cellulare e miRNPs. I siti di reticolati sono rivelati da timidina a transizioni citidina in cDNAs preparato da immunopurified RNPs di cellule 4-thiouridine-trattati. Abbiamo determinato i siti di legame e conseguenze normative per diversi RBPs intensamente studiato e miRNPs, tra cui PUM2, QKI, IGF2BP1-3, 4-fa/EIF2C1 e TNRC6A-C. Il nostro studio è emerso che questi fattori legano migliaia di siti che contengono motivi di sequenza definita e hanno preferenze distinte per untranslated esonico versus intronic o codifica versus regioni di trascrizione. La precisa mappatura dei siti di legame attraverso il trascrittoma sarà fondamentale per l'interpretazione dei dati rapidamente emergenti sulla variazione genetica tra individui e come tali variazioni contribuiscono a malattie genetiche complesse.
Analisi Genome-wide Di Abbondanza Di MRNA in Due Fasi Del Ciclo Di Vita Di Trypanosoma Brucei E L'identificazione Dei Siti Di Splicing E Poliadenilazione
Trascrizione di geni codificanti proteine in tripanosomi è policistronico ed espressione genica è regolata principalmente dai meccanismi di espresione. Motivi di sequenza nelle regioni non codificanti regolano mRNA trans-splicing e RNA stabilità, eppure dove UTRs iniziano e finiscono è noto per pochissimi geni. Abbiamo usato high-throughput RNA-sequenziamento per determinare che i livelli di mRNA di genome-wide steady-state ('transcriptomes') per circa il 90% del genoma nelle due fasi della vita Trypanosoma brucei ciclo coltivate in vitro. Quasi il 6% di geni differenzialmente espresse tra le due fasi del ciclo di vita. Abbiamo individuato 5' accettore di splice (SAS) e poliadenilazione siti (PAS) per geni 6959 e 5948, rispettivamente. La maggior parte dei geni sono tra uno e tre SAS alternativi, ma PAS sono più dispersi. Per 488 geni, sono stati identificati SAS a valle dell'iniziatore ATG, quindi una successiva nel telaio ATG presumibilmente indica l'inizio della vera sequenza codificante originariamente assegnato. In alcuni casi, alternativa SAS darebbe luogo a mRNA codificano per proteine con diverse sequenze di N-terminale. Noi potremmo identificare gli introni in due geni noti per contenerli, ma non trovato nessun altri geni con gli introni. Il nostro studio dimostra l'utilità della tecnologia RNA-seq per studiare il paesaggio trascrizionale di un organismo il cui genoma non è stata pienamente annotata.
Intero-exome Sequenziamento-based Scoperta Di STIM1 Deficit in Un Bambino Con Sarcoma Di Kaposi Classico Fatale
Classico sarcoma di Kaposi (KS) è estremamente raro nei bambini dal bacino del Mediterraneo, nonostante l'alta prevalenza di infezione da herpesvirus-8 umano (HHV-8) in questa regione. Abbiamo ipotizzato che il rari singolo-gene errori congeniti dell'immunità di HHV-8 possono essere alla base KS classico nell'infanzia. Abbiamo studiato un bambino con nessun altro fenotipo insolitamente grave infettiva o tumorale che morì da KS diffuse a due anni di età. Intero-exome sequenziamento nel paziente ha rivelato una mutazione omozigote splice-sito STIM1, il gene che codifica per molecola di interazione stromale 1, che regola il negozio gestito Ca(2+) voce. STIM1 mRNA impionbatura, produzione di proteine e Ca(2+) afflusso vennero completamente aboliti in linee di cellule di B EBV-trasformato dal paziente, ma sono stati salvati dall'espressione del selvaggio-tipo STIM1. Basato sulla precedente scoperta di STIM1 deficit in un'unica famiglia con un'immunodeficienza grave delle cellule T e il rischio molto più elevato di KS in individui con carenze acquisite delle cellule T, possiamo concludere che il deficit di cellule T STIM1 precipitato lo sviluppo di KS letale in questo bambino su infezione con HHV-8. La nostra relazione fornisce la prima evidenza che classico isolato KS nell'infanzia possono derivare da difetti del singolo-gene e fornisce la prova di principio che tutto-exome sequenziamento in singoli pazienti può decifrare le basi genetiche di rari errori congeniti.
ETV1 è Un Fattore Di Sopravvivenza Del Lignaggio Che Collabora Con Il KIT Nei Tumori Stromali Gastrointestinali
Tumore stromale gastrointestinale (GIST) è il più comune sarcoma umano ed è principalmente definita attivando le mutazioni della chinasi di tirosina del recettore KIT o PDGFRA. KIT è altamente espresso in cellule interstiziali di Cajal (ICCs) - la presunta cellula di origine per i GIST - così come in cellule staminali ematopoietiche, melanociti, mastociti e cellule germinali. Ancora, le famiglie che ospita germline attivando le mutazioni KIT e topi knock-in mutazioni Kit quasi esclusivamente sviluppano iperplasia ICC e GIST, suggerendo che il contesto cellulare è importante per il KIT di mediare oncogenesi. Qui ci mostra che il membro della famiglia ETS ETV1 è altamente espresso in sottotipi di ICCs KIT sensibili a oncogenica mediata trasformazione ed è necessario per il loro sviluppo. Inoltre, ETV1 è universalmente altamente espresso nei GIST ed è necessaria per la crescita di linee di cellule GIST imatinib-sensibili e resistenti. Transcriptome analisi globale e profilatura di siti leganti ETV1 suggeriscono che ETV1 è un regolatore master di una rete di trascrizione ICC-GIST-specifici principalmente attraverso enhancer binding. ETV1 programma trascrizionale è ulteriormente regolata da attivato KIT, che prolunga la stabilità proteica ETV1 e collabora con ETV1 per promuovere la tumorigenesi. Proponiamo che i GIST nasce dalla ICCs con alti livelli di espressione ETV1 endogena che, quando accoppiato con una mutazione attiva del KIT, spinge un programma di transcriptional ETS oncogenico. Questo differisce da altri tumori ETS-dipendente come il cancro alla prostata, melanoma e sarcoma di Ewing dove genomic traslocazione o amplificazione drives aberrante espressione di ETS. Esso rappresenta anche un nuovo meccanismo di attivazione di fattore di trascrizione oncogenica.
Soppressione Dell'infiammazione Di Un Mimic Sintetico Dell'istone
Interazione di agenti patogeni con le cellule del sistema immunitario risultati nell'attivazione dell'espressione genica infiammatoria. Questa risposta, anche se di vitale importanza per la difesa immunitaria, è spesso deleteria per l'host a causa della produzione esagerata di proteine infiammatorie. L'ambito delle risposte infiammatorie riflette lo stato di attivazione di proteine a Monte dei geni infiammatori come segnale indotta Assemblea dei complessi cromatina nucleare che supportano l'espressione del mRNA di segnalazione. Riconoscimento di istoni traduzionali modificati da proteine nucleari che avviare la trascrizione di mRNA e supportano allungamento di mRNA è un passaggio fondamentale nella regolazione dell'espressione genica. Qui vi presentiamo un nuovo approccio farmacologico tale espressione genica infiammatoria obiettivi interferendo con il riconoscimento di istoni acetilati e famiglia extra terminale dominio (BET) delle proteine. Descriviamo un composto sintetico (I-BET) 'imitando' istoni acetilati sconvolge complessi cromatina responsabile per l'espressione dei geni infiammatori chiave nei macrofagi attivati, che conferisce protezione contro shock settico indotte dal lipopolisaccaride e sepsi indotta da batteri. I nostri risultati suggeriscono che i composti sintetici mira specificamente le proteine che riconoscono gli istoni traduzionali modificati possono servire come una nuova generazione di farmaci immunomodulatori.
Livello Transcriptome Sequenziamento Rivela Numerose APOBEC1 Modifica Del MRNA Target Nella Trascrizione 3' UTRs
Apolipoproteina B-modifica enzimatico, catalitico polipeptide-1 (APOBEC1) è una deaminasi della citidina inizialmente identificata dalla sua attività di conversione di un specifico citosina (C) in uridina (U) in trascrizioni di apolipoproteina B (apoB) mRNA nel piccolo intestino. Modifica risultati nella traduzione di un'isoforma apoB troncato con funzioni distinte nel trasporto dei lipidi. Per affrontare la possibilità che APOBEC1 le modifiche aggiuntive mRNAs, abbiamo sviluppato un transcriptome-comparativo RNA (RNA-Seq) di sequenziamento schermo wide. Abbiamo individuato e convalidato 32 obiettivi precedentemente nuovo mRNA di APOBEC1 editing, che si trovano in segmenti AU-ricco di trascrizione non tradotta 3' regioni (3' UTRs). Un'ulteriore analisi stabilito diverse funzionalità caratteristica sequenza di obiettivi, che erano predittivi per l'individuazione di ulteriori APOBEC1 substrati di editing. L'approccio di trascrittomica al RNA editing presentati qui drammaticamente espande l'elenco dei APOBEC1 mRNA editing obiettivi e rivela un meccanismo cellulare romanzo per la modifica della trascrizione 3' UTRs.
Identificazione Di MRNA Editing Obiettivi Deaminasi Da RNA-Seq
Modifica deaminases RNA agiscono su una varietà di destinazioni in diversi organismi. Un certo numero di tali enzimi hanno dimostrato di agire sul mRNA, con le modifiche risultanti nucleotide modificando il contenuto informativo di una trascrizione. Anche se l'attività di deaminasi del mRNA editing enzimi è facilmente dimostrato in vitro, identificando i loro bersagli fisiologici ha dimostrato impegnativo. I recenti progressi nelle tecnologie di sequenziamento ad alta velocità ultra hanno permesso per il sequenziamento intero trascrittoma ed expression profiling (RNA-Seq). Abbiamo sviluppato un sistema per identificare il romanzo mRNA editing obiettivi deaminazione basati su un'analisi comparativa dei dati RNA-Seq. L'efficacia e l'utilità di questo approccio è dimostrato per APOBEC1, una deaminasi della citidina con una destinazione modifica mRNA noti e ben caratterizzati, nel piccolo intestino dei mammiferi.
Riconoscimento Di Un Modello Modifica Di Istone Mononucleosomal Da BPTF Tramite Interazioni Polivalente
Poco è conosciuto circa come combinazioni di segni dell'istone sono interpretati a livello dei nucleosomi. Il secondo dito PHD della BPTF umana è noto per riconoscere specificamente istone H3 quando metilato sulla lisina 4 (H3K4me2/3). Qui, esaminiamo come ulteriori modifiche heterotypic influenza associazione BPTF. Utilizzando surrogati del peptide, tre acetyllysine ligandi sono identificati per un dottorato di ricerca-adiacente che in BPTF via uno screening sistematico e caratterizzazione biofisica. Sebbene il che visualizza limitata discriminazione tra i tre acetyllysines possibili a livello di peptide, marcata selettività è osservato per uno solo di questi siti, H4K16ac, in combinazione con H3K4me3 a livello mononucleosome. Nel supporto, questi due marchi dell'istone costituiscono un modello di modifica unica trans-istone che senza ambiguità risiede all'interno di una singola unità nucleosomal in cellule umane, e questo modulo colocalizza con questi marchi nel genoma. Insieme, i nostri dati richiamano l'attenzione nucleosomal patterning di marchi covalenti nel dettare le associazioni critiche della cromatina.
Transcriptional Profilatura Della Psoriasi Utilizzando RNA-seq Rivela Non Precedentemente Identificato Differenzialmente Espressi Geni
Ambientale Con Codifica DNA Antibiotici Fasamycins A E B Inibire FabF Nella Biosintesi Degli Acidi Grassi Di II Tipo
In un recente studio di polyketide biosintetico gene cluster clonato direttamente dal suolo, abbiamo isolato due antibiotici, fasamycins A e B, che ha mostrato attività contro Staphylococcus aureus meticillino-resistente e Vancomicina-resistenti Enterococcus faecalis. Per identificare la destinazione della fasamycins, mutanti con concentrazioni inibitorie minime di elevata fasamycin A sono stati selezionati da una cultura di selvaggio-tipo di E. faecalis OG1RF. Sequenziamento di nuova generazione di questi mutanti, in collaborazione con dosaggi biochimici in vitro, hanno dimostrato che la fasamycins inibire FabF della biosintesi di acidi grassi II tipo (FABF6). Candidato gene sovraespressione studi hanno mostrato anche che fasamycin resistenza viene conferito dal fabF sovraespressione. Sulla base di confronti con noti inibitori di FABF6 e in silico docking studi, sottostruttura cloro-gemma-dimetil-anthracenone vista il fasamycins è previsto per rappresentare un natura FabF specifico antibiotico farmacoforo. Ottimizzazione di questo farmacoforo dovrebbe produrre antibiotici specifici FabF con potenze maggiori e diversi spettri di attività. Questo studio dimostra che metodi coltura-indipendente antibiotico scoperta hanno il potenziale per fornire accesso ai metaboliti romanzo con modalità di azione che differiscono da quelli degli antibiotici attualmente in uso clinico.
