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Articles by Sheldon S. Miller in JoVE
JoVE Neuroscience
Modèles expérimentaux pour l'étude de la physiologie épithélium pigmentaire rétinien et physiopathologie
National Eye Institute, National Institutes of Health
Nous fournissons une méthode reproductible pour la culture des monocouches confluentes de cellules foetales humaines épithélium pigmentaire rétinien (hfRPE) cellules qui présentent la morphologie, la physiologie, la polarité et de protéines et les profils d'expression génique du tissu natif adulte. Ce travail a été étendue à un modèle animal de plusieurs maladies oculaires.
Other articles by Sheldon S. Miller on PubMed
Le Agoniste Des Récepteurs P2Y (2) Stimule Le Transport Du Fluide INS37217 RPE in Vitro Et Réapplication De La Rétine Dans Rat
Pour étudier les effets de INS37217, un agoniste du récepteur P2Y synthétique (2), sur la signalisation intracellulaire de calcium, de l'électrophysiologie, et de transport de fluide in vitro et sur décollement de la rétine induite expérimentalement dans les yeux de rat in vivo.
Purinorécepteurs P2 Réguler Le Calcium Activé Par Le Chlorure Et Le Transport Des Fluides Dans Les épithéliums 31EG4 Mammaire
Il a été rapporté que sécrétoires des cellules épithéliales mammaires (MEC) la libération d'ATP, UTP, et UDP lors de la stimulation mécanique. Ici nous avons examiné les changements physiologiques causés par l'ATP / UTP dans non transformée, la souris clonale mammaire épithéliums (31EG4 cellules). Dans des conditions de contrôle, transépithélial potentiel (apicale côté négatif) et la résistance étaient -4.4 + / - 1,3 mV (moyenne + / - SD, n = 12) et 517.7 + / - 39,4 Omega. cm 2), respectivement. Le potentiel de membrane apicale était -43.9 + / - 1,7 mV, et le rapport de la apicale à la résistance membrane basolatérale (R (A) / R (B)) était de 3,5 + / - 0,2. Addition de l'ATP ou UTP aux membranes apicales ou basolatéral causé grandes variations de tension et une résistance à une CE (50) d'environ 24 microM (apicale) et environ 30 microM (basale). Apicale ATP / UTP (100 microM) potentiel dépolarisé la membrane apicale de 17,6 + / - 0,8 mV (n = 7) et une diminution de R (A) / R (B) par un facteur d'environ 3. L'ajout de l'adénosine de chaque côté (100 microM) n'a eu aucun effet sur l'un de ces paramètres. Les réponses ATP / UTP ont été partiellement inhibée par DIDS et la suramine et médiée par une augmentation transitoire de la concentration intracellulaire de Ca libre (2 +) de concentration (427 + / - 206 nM; 15-25 microM ATP, apicale; n = 6). Ce Ca (2 +) augmentation a été bloqué par l'acide cyclopiazonique, par BAPTA, ou par xestospongin monocouches C. MEC 31EG4 également sécrétée ou absorbé fluide à l'état de repos, et de l'ATP ou UTP augmentation de la sécrétion de fluide de 5,6 + / - 3 cm x microlitre (-2) xh (-1) (n = 10). Expériences de pharmacologie indiquent que 31EG4 épithéliums contiennent P2Y (2) purinorécepteurs sur les membranes apicales et basolatéral, qui lors de l'activation stimuler apicale Ca (2 +) canaux Cl-charge et provoquer la sécrétion de fluide à travers la monocouche. Ceci suggère que les nucléotides extracellulaires pourraient jouer un rôle fondamental dans la signalisation paracrine glande mammaire et la régulation de la composition du lait in vivo.
AAV-médiation Expression Du Facteur De Croissance Endothélial Vasculaire Induit Néovascularisation Choroïdienne Dans Rat
Pour développer un modèle animal de petite néovascularisation choroïdienne (NVC) en injectant virus adéno-associé (AAV)-VEGF dans l'espace sous-rétinien (SRS) de rats.
Fonction épithélium Pigmentaire Rétinien: Un Rôle Pour La Protéine CFTR?
Dans l'œil des vertébrés, les segments externes des photorécepteurs et la membrane apicale de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) sont séparés par un petit extracellulaire (sous-rétinien) espace dont le volume et la composition chimique varie à la lumière et l'obscurité. L'apparition de lumière déclenche relativement rapides (ms) des réponses de la rétine et beaucoup plus lents changements de tension et de résistance (s aux min) au niveau des membranes apicales et baso-latérale de l'EPR. Deux de ces réponses RPE lentes, l'oscillation rapide (FO) et la crête de lumière, sont mesurées cliniquement dans le cadre du électrooculogramme (EOG). Les deux réponses sont EOG médiée en partie par des protéines des membranes apicales et baso-latérale qui forment une voie pour le mouvement de sel et osmotiquement obligés de fluide à travers l'EPR, de la rétine au choroïde. Cette voie de transport sert à contrôler la composition chimique de volume et les espaces sous-rétiniens et choroïdiens extracellulaires. En RPE du fœtus humain, nous avons identifié une de ces protéines, le régulateur de la conductance transmembranaire de la mucoviscidose (CFTR) par RT-PCR, immunolocalisation, et des techniques électrophysiologiques. La preuve est présentée pour suggérer que la composante FO de l'EOG est médiée directement ou indirectement par la protéine CFTR.
Épissage Alternatif Du Gène APC Dans La Rétine Neurale Et L'épithélium Pigmentaire Rétinien
L'hypertrophie et l'hyperplasie de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est associée à une prédisposition héréditaire à l'homme familiales polypose adénomateuse familiale, suggérant que l'expression des polypose adénomateuse familiale (APC) suppresseur de tumeur peut réguler la prolifération RPE / différenciation. Isoformes APC distinctifs existent dans différents types cellulaires en raison de l'épissage alternatif des transcrits d'APC. Nous émettons l'hypothèse que les différences dans les profils d'expression des isoformes de la protéine APC sont essentiels à la RPE prolifération / différenciation.
(R)-acide Alpha-lipoïque Protège Les Cellules De L'épithélium Pigmentaire Contre Les Dommages Oxydatifs
Afin de déterminer si (R)-acide alpha-lipoïque (AL) protège culture foetales humaines épithéliales pigmentaires de la rétine (hfRPE) les cellules contre les dommages oxydatifs et d'identifier les voies qui peuvent intervenir dans la protection.
Monocouches Confluentes De La Morphologie Fœtale Humaines En Culture Pigmentaire Rétinien Pièce épithélium Et De Physiologie Du Tissu Natif
Fournir une méthode reproductible pour des monocouches de cellules confluentes culture hfRPE qui présentent la morphologie, la physiologie, la polarité, et les modes d'expression de protéines similaires à tissu natif.
Acroléine, Une Substance Toxique Dans La Fumée De Cigarette, Cause Des Dommages Oxydatif Et Le Dysfonctionnement Mitochondrial Dans Les Cellules RPE: La Protection Par (R)-acide Alpha-lipoïque
Pour mieux comprendre la cellule et la base moléculaire de l'association épidémiologique entre la fumée de cigarette, des blessures oxydant, et la dégénérescence maculaire liée à l'âge, les auteurs ont examiné les effets de l'acroléine, une substance toxique majeur dans la fumée de cigarette, sur les dommages oxydatifs dans mitochondriale épithélium pigmentaire rétinien ( RPE) des cellules et la réduction de ces dommages par l'acide lipoïque.
PDGF-C Et-D Induit Une Prolifération / Migration Des RPE Humain Est Aboli Par Des Cytokines Inflammatoires
Le rôle des facteurs de croissance et de l'inflammation dans la régulation de la rétine épithélium pigmentaire (RPE) la fonction est complexe et encore mal compris. La présente étude a examiné la prolifération des cellules humaines RPE et la migration induite par le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) et les cytokines inflammatoires.
Contrôle Des Gradients De Chimiokines Par L'épithélium Pigmentaire Rétinien
Cytokines pro-inflammatoires dans les maladies dégénératives peuvent conduire à la perte de la physiologie normale et la destruction des tissus environnants. Dans la présente étude, les réponses physiologiques de foetus humain épithélium pigmentaire rétinien (hfRPE) ont été examinés in vitro après activation des récepteurs de cytokines polarisée pro-inflammatoires.
Flagelline Stimulée Par Cl-sécrétion Et Les Réponses Immunitaires Innées à Airway épithéliums: Rôle Pour P38
Activation d'une réponse immunitaire innée dans les voies respiratoires épithéliums par le Pseudomonas aeruginosa pathogène humain nécessite l'expression de la flagelline bactérienne. Ajout de la flagelline (10 (-7) M) sur des monocouches de cellules épithéliales des voies aériennes (Calu-3, des voies respiratoires comme des cellules séreuses) accrue Cl (-) la sécrétion de (I (Cl)) début après 3-10 min, pour atteindre un plateau après 20-45 min à DELTAI (Cl) = 15-50 microA / cm (2). Similaires, bien que 10 fois plus petites, les réponses ont été observées dans bien différenciées bronchiques cultures épithéliales. Flagelline stimulée I (Cl) en présence d'au maximum stimuler doses de l'agoniste purinergique ATP, mais n'a pas d'effet suivantes forskoline. IL-1beta (produit à la fois par les épithéliums et les neutrophiles au cours des infections) a stimulé I (Cl) semblable à la flagelline. Flagelline-, IL-1beta-, ATP-, et la forskoline stimulée par I (Cl) ont été inhibées par la conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR régulateur), les bloqueurs GlyH101 CFTRinh172 et au glibenclamide. Ni la flagelline, ni l'IL-1beta modifié flux transépithélial de la membrane imperméant dextrane (10 kDa) ou Lucifer Yellow (poids moléculaire = 457), mais les deux p38 activée, NF-kB, et la sécrétion d'IL-8. Bloqueurs de p38 (SB-202190 et SB-203 580) a réduit la flagelline et l'IL-1beta stimulée par I (Cl) par 33-50%, mais a eu moins d'effets sur l'IL-8 et NF-kappaB. Il est conclu que: 1) la flagelline et l'IL-1beta p38 activée, NF-kB, IL-8, et la sécrétion d'anions CFTR-dépendante sans altérer la perméabilité des jonctions serrées; 2) p38 a joué un rôle dans la régulation de I (Cl) et de l'IL- 8, mais pas NF-kappa B, et 3) p38 était plus important dans la flagelline-que l'IL-1beta-stimulés réponses. Au cours des infections à P. aeruginosa, la flagelline et l'IL-1beta devraient augmenter CFTR-dépendante d'ions et le flux de fluide dans et la clairance bactérienne des voies respiratoires. Dans la mucoviscidose, la réponse sécrétoire serait absent, mais l'activation de p38, NF-kB, et IL-8 devrait persister.
Profil D'expression Génique Dans La Maladie Auto-immune Non Infectieux Uvéite
Uvéite non infectieuse est une prédominance des cellules T auto-immune, une maladie inflammatoire intraoculaire. Afin de caractériser le profil d'expression génique chez les patients souffrant d'uvéite non infectieuse, PBMC ont été isolées chez 50 patients atteints du syndrome de l'uvéite non infectieuse caractérisée cliniquement. Une voie spécifique des puces à ADN a été utilisé pour le profilage d'expression des gènes et en temps réel tableau PCR pour confirmation. Soixante-sept gènes inflammation et auto-immune associée ont été trouvés différentiellement exprimés chez les patients uvéite, avec 28 de ces gènes étant validées par PCR en temps réel. Plusieurs gènes précédemment inconnus de l'uvéite auto-immune, y compris IL-22, IL-19, IL-20, et IL-25/IL-17E, ont été trouvés à être fortement exprimée chez les patients uvéite par rapport aux sujets normaux avec de l'IL-22 expression hautement variable parmi les patients. En outre, nous montrons que l'IL-22 peuvent affecter les cellules humaines primaires de l'épithélium pigmentaire en diminuant la résistance du tissu total et induisant l'apoptose éventuellement en diminuant phospho-Bad niveau. En outre, les données de microarray a identifié un possible uvéite associée à profil d'expression génique, a montré distinctes profils d'expression génique chez les patients pendant les périodes d'activité clinique et la quiétude, et a démontré des profils d'expression similaires chez les patients ayant les mêmes liées à des phénotypes cliniques. Nos données fournissent la première preuve qu'un sous-ensemble de l'IL-10 gènes de la famille sont impliqués dans l'uvéite non infectieuse et que l'IL-22 peuvent affecter les cellules humaines épithélium pigmentaire rétinien. Les résultats peuvent faciliter davantage la compréhension des mécanismes moléculaires de l'uvéite auto-immune et d'autres auto-immunes origine des maladies inflammatoires.
Expression, Localisation Et Fonction De La Molécule D'adhésion Jonctionnelle-C (JAM-C) Dans L'épithélium Pigmentaire Rétinien Humain
Pour déterminer la localisation de JAM-C dans RPE humaine et de caractériser ses fonctions.
Induit Par Le CO2 Ion Et Le Transport Des Fluides Dans La Rétine Humaine épithélium Pigmentaire
Dans l'œil intact, la transition de la lumière à pH modifie sombre, [Ca 2 +] et [K] dans l'espace sous-rétinien (SRS) qui sépare les segments externes des photorécepteurs et la membrane apicale de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR). En plus de ces changements, la consommation d'oxygène de la rétine augmente avec une libération concomitante de CO2 et H2O dans le SRS. Le RPE maintient le pH SRS et l'homéostasie du volume par le transport de ces sous-produits métaboliques de l'approvisionnement en sang choroïdienne. In vitro, nous avons imité la transition de la lumière à l'obscurité par l'augmentation du CO2 de bain apicales de 5 à 13%; cette manœuvre une diminution du pH des cellules à partir de 7,37 + / - 0,05 à 7,14 + / - 0,06 (n = 13). Notre analyse de la maternelle et de culture RPE du foetus humain montre que la membrane apicale est beaucoup plus perméable (environ 10 fois; n = 7) pour le CO2 que la membrane basolatérale, peut-être en raison de sa plus grande surface exposée. La diffusion limitée de CO2 à la membrane basolatérale favorise l'anhydrase carbonique transport médié par une membrane HCO3 Na/nHCO3 cotransporteur basolatéral. L'activité de ce transporteur a été augmenté par l'élévation du CO2 de bain apicales et a été réduit de dorzolamide. L'augmentation des émissions de CO2 de bain apicales a également augmenté, passant de 15,7 Na intracellulaire + / - 3,3 à 24,0 + / - 5,3 mm (n = 6; P <0,05) en augmentant la membrane apicale Na absorption. L'acidification induit par le CO2 a également inhibé la membrane basolatérale Cl/HCO3 échangeur et une augmentation nette d'absorption de fluide l'état d'équilibre de 2,8 + / - 1.6 à 6.7 + / - 2,3 cm x microl (-2) x h (-1) (n = 5; P <0,05). Les expériences actuelles montrent comment l'EPR peut accueillir l'augmentation de la production de CO2 et de la rétine H (2) O dans l'obscurité, empêchant ainsi l'acidose dans le SRS. Ce processus homéostatique permettrait de préserver la relation anatomique étroite entre les segments externes des photorécepteurs et l'EPR dans l'obscurité et la lumière, protégeant ainsi la santé des photorécepteurs.
Integrin Alpha5beta1 Médiateur Pièce Jointe, La Migration Et La Prolifération Dans L'épithélium Pigmentaire Rétinien Humain: Pertinence De La Maladie De La Rétine Proliférante
Le but de cette étude était de déterminer l'expression et la localisation de l'intégrine alpha5beta1 dans l'épithélium pigmentaire humaine rétinien (EPR) et sa capacité à moduler la fixation des cellules RPE, la prolifération, la migration, et la distribution du cytosquelette d'actine F-.
IFN {gamma} Régule La Rétine De L'épithélium Pigmentaire De Transport De Fluide
Les expériences actuelles montrent que les récepteurs IFNgamma sont principalement localisés sur la membrane basolatérale de l'épithélium pigmentaire humaine rétinien (EPR). L'activation de ces récepteurs dans des cultures primaires de RPE du fœtus humain inhibe la prolifération cellulaire et la migration, diminution du potentiel de membrane mitochondriale RPE, modifié potentiel transépithélial et la résistance, et a considérablement augmenté l'absorption de liquide transépithélial. Ces effets sont médiés par JAK-STAT et p38 MAPK voies de signalisation. Second messager AMPc-signalisation par voie PKA et la production d'interféron réglementaire facteur-1-dépendante de l'oxyde nitrique / cGMP stimulé la CFTR à la membrane basolatérale et augmentation de l'absorption de fluide transépithélial. In vivo expériences utilisant un modèle de rat de réapplication de la rétine a montré que IFNgamma appliqué à la surface antérieure de l'œil peut retirer du liquide supplémentaire déposé dans l'espace extracellulaire ou sous-rétinien entre les photorécepteurs de la rétine et RPE. Enlèvement de ce fluide d'appoint est bloquée par une combinaison de PKA et inhibiteurs de la voie JAK-STAT injectés dans l'espace sous-rétinien. Ces résultats démontrent un rôle protecteur pour IFNgamma dans la régulation de l'hydratation rétine externe à travers la barrière hémato-rétinienne dans les processus de maladies inflammatoires et de fournir la base pour d'éventuelles interventions thérapeutiques.
MicroRNA-204/211 Alters Physiologie épithéliale
MicroARN (miARN) expression dans fœtale épithélium pigmentaire rétinien humain (hfRPE), la rétine, et de la choroïde ont été deux à deux par rapport à déterminer les miARN qui sont enrichies de 10 fois ou plus dans chacun des tissus par rapport à ses deux voisins. mirs-184, 187, 200a/200b, 204/211, et 221/222 sont enrichis en hfRPE de 10 - à 754 fois par rapport à neurorétine ou de la choroïde (P <0,05). Cinq de ces miARN sont enrichis en RPE par rapport à 20 tissus de l'organisme et sont de 10 - à 20.000 fois plus fortement exprimée (P <0,005). miR-204 et 211 sont les plus fortement exprimé dans le RPP. En outre, l'expression de miR-204/211 est significativement plus faible dans le panneau de cellules tumorales NCI60 ligne par rapport à ce que dans 13 tissus normaux, suggérant la rupture progressive des barrières épithéliales et la prolifération accrue. Nous avons démontré que le TGF-beta receptor 2 (TGF-betaR2) et SNAIL2 sont des cibles directes de miR-204 et qu'une réduction de miR-204 conduit à l'expression une expression réduite de claudines 10, 16, et 19 (message / protéines) compatible avec notre observation selon laquelle anti-miR-204/211 diminution de la résistance transépithéliale de 80% et réduit la tension membrane cellulaire et de la conductance. La diminution anti-miR-204-induite dans la teneur en protéines Kir7.1 suggère une voie de signalisation TGF-qui relie betaR2 et le maintien de l'homéostasie du potassium. Dans l'ensemble, ces données indiquent un rôle crucial dans le maintien de miR-204/211 pour fonction de barrière épithéliale et la physiologie cellulaire.
Le Nouveau Paradigme: La Rétine Cellules D'épithélium Pigmentaire Générées à Partir Embryonnaires Ou Cellules Souches Pluripotentes Induites
Par rapport à la crête neurale dérivés mélanocytes, la rétine épithélium pigmentaire (RPE) des cellules à l'arrière de l'œil sont des cellules pigmentaires de nature différente. Ils sont une partie du cerveau, former une monocouche épithéliale, de répondre aux différents signaux extracellulaires, et assurent des fonctions qui dépassent de loin celles d'un écran absorbant la lumière. Par exemple, ils contrôlent le flux de nutriments et de son métabolite à destination et en provenance de la rétine, de reconstituer 11-cis-rétinal en ré-isomérisation tout-trans-rétinal généré au cours de photoconversion, phagocytent quotidienne d'une partie des segments les photorécepteurs des extérieurs, et sécrètent des cytokines que, localement, contrôler les systèmes immunitaire innée et adaptative. Il n'est pas surprenant, des dommages aux cellules RPE est une cause majeure de cécité dans le monde de l'homme, à la dégénérescence maculaire liée au vieillissement un exemple répandu. Thérapies de remplacement de RPE en utilisant des cellules RPE générés à partir d'embryons ou de cellules souches pluripotentes induites offrir une nouvelle approche à un traitement rationnel de ces formes de cécité. En fait, RPE-comme les cellules peuvent être obtenues assez facilement lorsque les cellules souches sont soumis à un protocole d'induction en deux étapes, une première étape qui mène à un destin neuroectodermique et une seconde pour RPE différenciation. Ici, nous discutons les caractéristiques de ces cellules, proposer des critères qu'ils doivent remplir pour être considéré comme des cellules RPE authentiques, et souligner les défis d'un visage lors de l'utilisation de telles cellules dans les tentatives pour restaurer la vision.
CNTF Médiateur Sécrétion Du Facteur Neurotrophique Et L'absorption De Liquide Dans La Rétine Humaine épithélium Pigmentaire
Facteur neurotrophique ciliaire (CNTF) protège les photorécepteurs et réglemente leurs machines phototransduction, mais on sait peu sur les effets du CNTF sur épithélium pigmentaire rétinien (EPR) physiologie. Par conséquent, nous avons déterminé l'expression et la localisation des récepteurs CNTF et les conséquences physiologiques de leur activation dans des cultures primaires de RPE du fœtus humain (hfRPE). Cultured hfRPE expresse CNTF, CT1, et l'OSM et de leurs récepteurs, y compris CNTFRα, LIFRβ, gp130, et OsMRβ, tous localisés principalement à la membrane apicale. Exogène CNTF, CT1, ou OSM induit la phosphorylation STAT3, et OSM induit également la phosphorylation de ERK1 / 2 (p44/42 MAP kinase). CNTF augmente la survie RPE, mais pas les taux de phagocytose. CNTF augmente la sécrétion de NT3 au bain apical et diminue celle de VEGF, IL8, et TGFβ2. Il augmente aussi considérablement l'absorption de liquide (J (V)) à travers des monocouches intactes de hfRPE en activant les canaux chlorure CFTR à la membrane basolatérale. CNTF induit de profonds changements dans la biologie des cellules RPE, de la biochimie et la physiologie, y compris l'augmentation de la survie cellulaire, la sécrétion polarisée des cytokines ou des facteurs neurotrophiques, et l'augmentation de l'absorption des fluides état d'équilibre de signalisation médiée par JAK/STAT3. In vivo, ces changements, prises ensemble, pourraient servir à réguler le microenvironnement autour de la rétine distale / complexe de la membrane RPE / Bruch et fournir une protection contre les maladies neurodégénératives.
