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Articles by Sheldon S. Miller in JoVE
JoVE Neuroscience
Modelos experimentales para el estudio de la fisiología epiteliales del pigmento retiniano y fisiopatología
National Eye Institute, National Institutes of Health
Ofrecemos un método reproducible para el cultivo de las monocapas confluentes de células fetales humanas del epitelio pigmentario de la retina (hfRPE) las células que presentan la morfología, la fisiología, la polaridad, y la proteína y los patrones de expresión génica del tejido nativo adulto. Este trabajo se ha extendido a un modelo animal de enfermedades de los ojos de varios.
Other articles by Sheldon S. Miller on PubMed
El P2Y (2) Agonista Del Receptor Estimula El Transporte De Fluidos INS37217 RPE in Vitro Y Reaplicación Retiniana En Ratas
Para investigar los efectos de INS37217, un P2Y sintética (2) agonista de los receptores, en la señalización intracelular de calcio, la electrofisiología, y el transporte de fluidos in vitro y el desprendimiento de la retina inducida experimentalmente en los ojos de rata in vivo.
Purinoceptors P2 Regular El Calcio Activada Por El Cloruro Y El Transporte De Fluidos En El Epitelio Mamario 31EG4
Se ha informado que las células epiteliales mamarias secretoras (MEC) de liberación de ATP, UTP, y UDP a la estimulación mecánica. Aquí examinamos los cambios fisiológicos causados por la ATP / UTP en no transformado, el ratón clonal epitelio mamario (31EG4 las células). En las condiciones de control, el potencial transepitelial (apical lado negativo) y la resistencia fueron -4,4 + / - 1,3 mV (media + / - DS, n = 12) y 517.7 + / - 39,4 Omega. cm (2), respectivamente. El potencial de la membrana apical fue -43,9 + / - 1,7 mV, y la relación de apical a resistencia de la membrana basolateral (R (A) / R (B)) fue 3,5 + / - 0,2. La adición de ATP o UTP a las membranas apicales o basolateral causado grandes cambios de tensión y resistencia con un CE (50) de aproximadamente 24 microM (apical) y aproximadamente 30 microM (basal). Apical ATP / UTP (100 microM) despolariza el potencial de membrana apical en un 17,6 + / - 0,8 mV (n = 7) y la disminución de R (A) / R (B) por un factor de aproximadamente 3. La adición de adenosina a cada lado (100 microM) no tuvo efecto sobre cualquiera de estos parámetros. Las respuestas ATP / UTP fueron parcialmente inhibida por DID y la suramina y mediado por un aumento transitorio de la libre intracelular de Ca (2 +) la concentración (427 + / - 206 nm; 15-25 microM ATP, apical, n = 6). Este Ca (2 +) aumento fue bloqueado por el ácido ciclopiazónico, por BAPTA, o por xestospongin monocapas C. 31EG4 MEC también se secreta o se absorbe líquido en el estado de reposo, y el ATP o UTP aumento de la secreción de fluidos en un 5,6 + / - 3 cm x microlitro (-2) xh (-1) (n = 10). Farmacología experimentos indican que 31EG4 epitelios contienen P2Y (2) purinoceptors en las membranas apical y basolateral, que estimulan la activación apical Ca (2 +)-dependientes canales Cl y provocar la secreción de fluidos a través de la monocapa. Esto sugiere que los nucleótidos extracelulares podría desempeñar un papel fundamental en la señalización de la glándula mamaria paracrina y la regulación de la composición de la leche en vivo.
AAV-mediada Por La Expresión Del Factor De Crecimiento Endotelial Vascular Induce La Neovascularización Coroidea En La Rata
Para desarrollar un modelo de pequeños animales de la neovascularización coroidea (NVC) mediante la inyección de virus adeno-asociado (AAV)-VEGF en el espacio subretiniano (SRS) de las ratas.
Función EPR: Un Papel Para CFTR?
En el ojo de los vertebrados, los segmentos externos de los fotorreceptores y la membrana apical del epitelio pigmentario de la retina (EPR) están separados por una pequeña extracelular (subretiniana) el espacio cuyo volumen y composición química varía en la luz y la oscuridad. La aparición de luz desencadena respuestas retinales relativamente rápido (ms) y mucho más lentos los cambios de voltaje y resistencia (s para min) en la membrana apical y basolateral de la RPE. Dos de estas respuestas RPE lentos, la oscilación rápida (FO) y el pico de la luz, se miden clínicamente como parte de la electrooculograma (EOG). Ambas respuestas son EOG mediada en parte por las proteínas de las membranas apical y basolateral, que forman un camino para el movimiento de la sal y osmóticamente obligada líquido a través de la RPE, de la retina a la coroides. Esta vía de transporte sirve para controlar la composición química y volumen de los espacios extracelulares subretinal y coroidal. En EPR fetal humano, hemos identificado una de estas proteínas, la transmembrana de la fibrosis quística regulador de la conductancia (CFTR) por RT-PCR, inmunolocalización y técnicas electrofisiológicas. Se presenta evidencia para sugerir que el componente FO del EOG está mediada directa o indirectamente por CFTR.
Splicing Alternativo Del Gen APC En La Retina Neural Y El Epitelio Pigmentario Retiniano
La hipertrofia y la hiperplasia del epitelio pigmentario de la retina (EPR) está asociada con una predisposición hereditaria a humanos E. poliposis adenomatosa familiar, lo que sugiere que la expresión de la poliposis adenomatosa (APC), supresor de tumores puede regular la proliferación RPE / diferenciación. Isoformas distintivos de APC existen en diferentes tipos de células, debido a splicing alternativo de las transcripciones de APC. Nuestra hipótesis es que las diferencias en los patrones de expresión de las isoformas de la proteína APC son esenciales para la proliferación RPE / diferenciación.
(R)-alfa-lipoico Protege a Las Células Epiteliales Del Pigmento Retinal Del Daño Oxidativo
Para determinar si (R)-alfa-lipoico (LA) protege a los cultivos humanos fetales del epitelio pigmentario (hfRPE) las células contra el daño oxidativo e identificar las vías que pueden mediar en la protección.
Monocapas Confluentes De Humanas Cultivadas Morfología Fetal Prueba La Retina Del Epitelio Pigmentario Y Fisiología Del Tejido Nativo
Proporcionar un método reproducible para el cultivo de las monocapas confluentes de células hfRPE que presentan la morfología, la fisiología, la polaridad, y los patrones de expresión de proteínas similares a las del tejido nativo.
La Acroleína, Una Sustancia Tóxica En El Humo Del Cigarrillo, Que Causa Daño Oxidativo Y La Disfunción Mitocondrial En Las Células Del EPR: Protección Por (R)-alfa-lipoico
Para comprender mejor el celular y bases moleculares de la asociación epidemiológica entre el humo del cigarrillo, estrés oxidativo, y asociada con la edad degeneración macular, los autores examinaron los efectos de la acroleína, una sustancia tóxica importante en el humo del cigarrillo, el daño oxidativo mitocondrial en el epitelio pigmentario retiniano ( RPE) las células y la reducción del daño por el ácido lipoico.
PDGF-C Y-D Inducida Por La Proliferación / Migración De EPR Humano Es Abolido Por Citoquinas Inflamatorias
El papel de los factores de crecimiento y en la regulación de la inflamación del epitelio pigmentario de la retina (EPR) la función es compleja y aún es poco conocido. El presente estudio investigó la proliferación de células humanas EPR y mediada por la migración de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y citoquinas inflamatorias.
Control De Los Gradientes De Quimioquinas Por El Epitelio Pigmentario De La Retina
Las citoquinas proinflamatorias en las enfermedades degenerativas puede conducir a la pérdida de la fisiología normal y la destrucción de los tejidos circundantes. En el presente estudio, las respuestas fisiológicas de fetos humanos epitelio pigmentario de la retina (hfRPE) se analizaron in vitro después de la activación de los receptores de polarización de citoquinas proinflamatorias.
Flagelina Estimulada Por La Secreción De Cl-y La Respuesta Inmune Innata En Las Vías Respiratorias Epitelios: Papel Para La P38
La activación de una respuesta inmune innata en las vías respiratorias epitelios por el patógeno humano Pseudomonas aeruginosa requiere la expresión bacteriana de flagelina. La adición de flagelina (10 (-7) M) a las monocapas de células epiteliales de las vías respiratorias (Calu-3, las vías respiratorias, como las células serosas) aumento de Cl (-) secreción (I (Cl)) comenzando después de 3-10 minutos, hasta alcanzar una meseta después de 20-45 min en DeltaI (Cl) = 15-50 microA / cm (2). Similares, aunque 10 veces más pequeñas, las respuestas se observaron en las culturas bien diferenciadas del epitelio bronquial. Flagelina estimulada I (Cl) en presencia de máximamente estimular dosis del agonista purinérgico ATP, pero no tuvo efectos siguientes forskolina. IL-1 beta (producido por ambos epitelios y los neutrófilos durante las infecciones) que estimula (Cl), similar a la flagelina. Flagelina, IL-1 beta, ATP, y estimulada por forscolina I (Cl) fueron inhibidos por la fibrosis quística regulador de la conductancia transmembrana (CFTR), los bloqueadores GlyH101 CFTRinh172 y glibenclamida. Ni flagelina, ni IL-1beta alterado los flujos transepitelial de membrana impermeant dextrano (10 kDa) o amarillo lucifer (peso molecular = 457), pero ambos p38 activada, NF-kappaB, y la secreción de IL-8. Bloqueadores de p38 (SB-202190 y SB-203580) redujo flagelina y la IL-1 beta estimulada I (Cl) por 33 a 50%, pero tuvo poco efecto sobre la IL-8 y NF-kappaB. Se concluye que: 1) flagelina y la IL-1 beta p38 activada, el NF-kappaB, IL-8, y el CFTR dependiente de la secreción de aniones, sin alterar la permeabilidad de las uniones estrechas, 2) p38 juega un papel en la regulación de I (Cl) y la IL- 8 pero no de NF-kappaB, y 3) p38 fue más importante en la flagelina-que la IL-1 beta-estimulados respuestas. En infecciones por P. aeruginosa, flagelina y la IL-1 beta se espera que aumenten CFTR dependiente de iones y el flujo de fluido de entrada y la eliminación de bacterias de las vías respiratorias. En la fibrosis quística, la respuesta secretora estaría ausente, pero la activación de p38, NF-kappaB, e IL-8 que persisten.
Perfil De Expresión Genética En Las Enfermedades Autoinmunes Uveítis No Infecciosa
Uveítis no infecciosa es predominantemente mediada por células T enfermedad autoinmune, inflamatoria intraocular. Para caracterizar el perfil de expresión génica de pacientes con uveítis no infecciosa, PBMCs fueron aisladas de 50 pacientes con síndrome clínico caracterizado uveítis no infecciosas. Un camino específico de microarrays de cDNA se utilizó para perfiles de expresión génica y en tiempo real PCR para la matriz de una confirmación posterior. Sesenta y siete genes de inflamación y autoinmune asociada-se encontraron expresados diferencialmente en los pacientes con uveítis, con 28 de esos genes están validados por PCR en tiempo real. Varios genes previamente desconocidas para la uveítis autoinmune, incluyendo la IL-22, IL-19, IL-20, y IL-25/IL-17E, resultaron ser altamente expresado en los pacientes con uveítis en comparación con los sujetos normales con alta expresión de IL-22 variable entre los pacientes. Además, nos muestran que la IL-22 puede afectar a las células humanas primarias del epitelio pigmentario de la retina por la disminución de la resistencia del tejido total y la inducción de apoptosis, posiblemente por la disminución de fosfo-Bad nivel. Además, los datos de microarrays identificado un posible uveítis asociada a patrón de expresión génica, mostraron diferentes perfiles de expresión génica en pacientes durante los períodos de actividad clínica y la tranquilidad, y demostró similares patrones de expresión en los pacientes relacionados con similares fenotipos clínicos. Nuestros datos proporcionan la primera evidencia de que un subconjunto de la IL-10 genes de la familia están implicados en la uveítis no infecciosas y que la IL-22 puede afectar a las células del epitelio pigmentario de la retina. Los resultados pueden facilitar aún más la comprensión de los mecanismos moleculares de uveítis autoinmune y otras enfermedades inflamatorias autoinmunes originaron.
Expresión, Localización Y Función De La Unión De La Molécula De Adhesión-C (JAM-C) En El Epitelio Pigmentario De La Retina Humana
Para determinar la localización de JAM-C en el RPE humano y caracterizar sus funciones.
Inducido Por El CO2 De Iones Y El Transporte De Fluidos En El Epitelio Pigmentario De La Retina Humana
En el ojo intacto, la transición de la luz a la oscuridad del pH se altera, [Ca2 +] y [K] en el espacio subretinal (SRS) que separa los segmentos externos de los fotorreceptores y la membrana apical del epitelio pigmentario de la retina (EPR). Además de estos cambios, el consumo de oxígeno en la retina aumenta con una concomitante liberación de CO2 y H2O en el SRS. El EPR mantiene el pH SRS y la homeostasis del volumen mediante el transporte de estos subproductos metabólicos para el suministro de sangre coroidea. In vitro, que imita la transición de claro a oscuro por el aumento de CO2 apicales de baño 5 a 13%, esta maniobra disminuye el pH celular de 7,37 + / - 0,05 a 7,14 + / - 0,06 (n = 13). El análisis de nativo y cultivado EPR fetal humano muestra que la membrana apical es significativamente más permeable (aproximadamente 10 veces, n = 7) a CO2 que la membrana basolateral, quizás debido a su mayor área superficial expuesta. La limitada difusión de CO2 en la membrana basolateral de la anhidrasa carbónica promueve el transporte mediado por HCO3 por una membrana basolateral Na/nHCO3 cotransportador. La actividad de este transportador se incrementó mediante la elevación de CO2 apicales de baño y se redujo por dorzolamida. El aumento de CO2 de baño apical también se incrementó de 15.7 intracelular de Na + / - 3,3 a 24,0 + / - 5,3 mm (n = 6, p <0,05) al aumentar la absorción de la membrana apical de Na. La acidificación de CO2 inducida también inhibió la membrana basolateral Cl/HCO3 intercambiador y el aumento neto en estado estacionario la absorción de líquido de 2,8 + / - 1,6 a 6,7 + / - 2,3 microlitros x cm (-2) x hr (-1) (n = 5, p <0,05). Los experimentos actuales muestran cómo el EPR puede acomodar el aumento de la producción de CO2 y la retina H (2) O en la oscuridad, evitando así que la acidosis en el SRS. Este proceso homeostático que preservar la estrecha relación anatómica entre los segmentos externos de los fotorreceptores y RPE en la oscuridad y la luz, protegiendo así la salud de los fotorreceptores.
Integrina Alpha5beta1 Media La Vinculación, La Migración Y La Proliferación En El Epitelio Pigmentario De La Retina Humana: Importancia Para La Enfermedad De La Retina Proliferativa
El objetivo de este estudio fue determinar la expresión y localización de la integrina alpha5beta1 humana en el epitelio pigmentario retiniano (EPR) y su capacidad para modular la unión de las células RPE, la proliferación, migración y distribución de F-actina del citoesqueleto.
IFN Gamma} {regula El Transporte Del Epitelio Pigmentario De Fluidos
Los experimentos actuales muestran que los receptores de IFNgamma se localizan principalmente en la membrana basolateral del epitelio pigmentario de la retina humana (EPR). La activación de estos receptores en cultivos primarios de RPE fetal humano inhibe la proliferación celular y la migración, la disminución del potencial de membrana mitocondrial RPE, alteración potencial transepitelial y la resistencia, y aumentó significativamente la absorción de líquidos transepitelial. Estos efectos están mediados por JAK-STAT y p38 MAPK vías de señalización. Segundo mensajero cAMP señalización a través de PKA y la producción de interferón factor de regulación-1-dependiente de óxido nítrico / cGMP estimulado la CFTR en la membrana basolateral y el aumento de la absorción de líquidos transepitelial. En experimentos in vivo utilizando un modelo de rata de reaplicación retiniana mostró que IFNgamma aplicado a la superficie anterior del ojo puede eliminar el exceso de líquido depositado en el espacio extracelular o subretinal entre los fotorreceptores de la retina y EPR. La eliminación de este exceso de líquido fue bloqueado por una combinación de PKA y JAK-STAT inhibidores de la vía inyectada en el espacio subretiniano. Estos resultados demuestran un papel protector en la regulación de la hidratación IFNgamma la retina externa a través de la barrera hemato-retiniana en los procesos de las enfermedades inflamatorias y proporcionar la base para posibles intervenciones terapéuticas.
MicroRNA-204/211 Altera Epitelial Fisiología
MicroRNA (miRNA) en la expresión del feto del epitelio pigmentario de la retina humana (hfRPE), la retina y la coroides se compararon por pares para determinar los miRNAs que se enriquecen en 10 veces o más en cada tejido en comparación con sus dos vecinos. MIR-184, 187, 200a/200b, 204/211, y 221/222 se enriquecen en hfRPE en un 10 - a 754 veces en comparación con retiniana o coroidea (P <0,05). Cinco de estos miRNAs se enriquecen en el RPE en comparación con 20 tejidos de todo el cuerpo y son 10 - a 20.000 veces más alta expresión (P <0,005). miR-204 y 211 son los más altamente expresado en el EPR. Además, la expresión de miR-204/211 es significativamente menor en el panel de la línea NCI60 de las células tumorales en comparación con la de 13 tejidos normales, lo que sugiere la interrupción progresiva de las barreras epiteliales y aumento de la proliferación. Hemos demostrado que el TGF-beta receptor 2 (TGF-betaR2) y Snail2 son blancos directos de miR-204 y que una reducción en la expresión de miR-204 conduce a la reducción de expresión de claudinas 10, 16 y 19 (mensaje / proteína) en consonancia con nuestra observación de que anti-miR-204/211 disminución de la resistencia transepitelial un 80% y voltaje reducido membrana celular y la conductancia. La disminución anti-MIR-204-inducida en Kir7.1 niveles de proteína sugiere una vía de señalización que conecta el TGF-betaR2 y mantenimiento de la homeostasis del potasio. En general, estos datos indican un papel fundamental para miR-204/211 en el mantenimiento de la función de barrera del epitelio y de la fisiología celular.
El Nuevo Paradigma: La Retina Las Células Del Epitelio Pigmentario De Creación De Células Madre Embrionarias O Pluripotentes Inducidas
En comparación con los de la cresta neural derivados de los melanocitos, epitelio pigmentario de la retina (EPR), las células en la parte posterior del ojo son las células de pigmento de un tipo diferente. Ellos son una parte del cerebro, forman una monocapa epitelial, responden a distintas señales extracelulares, y proporcionar funciones que exceden las de una pantalla que absorbe la luz. Por ejemplo, controlan el flujo de nutrientes y el metabolito hacia y desde la retina, reponer 11-cis-retinal por re-isomerizar todo-trans-retinal generado durante fotoconversión, fagocitan diariamente una porción de los segmentos de los fotorreceptores de los exteriores, y secretan citoquinas que a nivel local controlar el sistema inmune innato y adaptativo. No es de extrañar, el daño de células RPE es una causa importante de ceguera en el mundo humano, con la degeneración macular relacionada con la edad un ejemplo frecuente. Terapias de reemplazo del EPR con las células del EPR generados a partir de células madre embrionarias o pluripotentes inducidas ofrecer un nuevo enfoque para un tratamiento racional de estas formas de ceguera. De hecho, EPR-como las células se pueden obtener con relativa facilidad cuando las células madre se somete a un protocolo de inducción de dos pasos, un primer paso que conduce a un destino neuroectodérmico y una segunda a RPE diferenciación. En este caso, hablamos de las características de estas células, proponer los criterios que deben cumplir para ser considerados auténticas células del EPR, y señalar los desafíos que uno se enfrenta cuando se utilizan estas células en los intentos de restaurar la visión.
CNTF Factor Neurotrófico Media La Secreción Y La Absorción De Fluidos En El Epitelio Pigmentario De La Retina Humana
Factor neurotrófico ciliar (CNTF) protege los fotorreceptores y regula su maquinaria fototransducción, pero poco se sabe sobre los efectos de CNTF en epitelio pigmentario de la retina (EPR) la fisiología. Por lo tanto, se determinó la expresión y localización de los receptores de CNTF y la consecuencia fisiológica de su activación en cultivos primarios de RPE de fetos humanos (hfRPE). Cultivadas hfRPE expresa CNTF, CT1, y la OSM y sus receptores, entre ellos CNTFRα, LIFRβ, gp130, y OsMRβ, todos localizados principalmente en la membrana apical. Exógenos CNTF, CT1, o OSM induce la fosforilación de STAT3, y OSM también induce la fosforilación de ERK1 / 2 (p44/42 MAP quinasa). CNTF aumenta la supervivencia de EPR, pero no las tasas de la fagocitosis. CNTF aumenta la secreción de TE3 al baño apical y disminuye la de VEGF, IL8, y TGFβ2. También aumenta significativamente la absorción de líquidos (J (V)) a través de monocapas intactas de hfRPE mediante la activación de los canales de cloruro CFTR en la membrana basolateral. CNTF induce cambios profundos en la biología celular RPE, la bioquímica y la fisiología, incluyendo el aumento en la supervivencia celular, la secreción polarizada de citoquinas y factores neurotróficos, y el aumento en la absorción de fluido en estado estacionario mediada por JAK/STAT3 señalización. In vivo, estos cambios, en conjunto, podría servir para regular el microambiente alrededor de la retina distal / complejo de la membrana RPE / Bruch 's y proporcionar protección contra la enfermedad neurodegenerativa.
