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Articles by Shenyuan Zhang in JoVE
JoVE General
使用Qiagen公司的小量制备试剂盒的细菌菌落纯化质粒DNA
Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine (UCI)
Other articles by Shenyuan Zhang on PubMed
C.线虫南宝域转录因子 UNC 86 规定了具体 Serotonergic 神经元 Tph 1 色氨酸羟化酶基因和轴突产物。
在发育神经生物学中一个根本的问题是如何在不同的神经元类型中指定是常见的神经递质？。我们用来南宝转录因子 UNC 86 线虫进行描述的 serotonergic 表型的特定单元格的调节。我们显示该 unc 86 规定了四类 serotonergic 神经元，在终端的神经元身份的特殊方面，但 ADF serotonergic 神经元的发展由独立的 UNC-86 程序规管。NSM 神经元，unc 86 的作用局限在后期分化 ；神经元生成的但做不表达基因 serotonergic 感受器的必要条件。unc-86-null 突变影响 NSM 中 tph-1，对 5-羟色胺合成的酶色氨酸羟化酶进行编码，和猫 1，它将加载到突触小泡，这表明该 unc 86 协调调节 5-羟色胺合成和包装的 5-羟色胺的水疱转运蛋白编码的表达式。然而，unc-86-null 突变不损害再摄取 5-羟色胺从 ADF serotonergic 化学感受神经元释放 NSM 的能力和这 5-羟色胺再摄取是敏感的 5-羟色胺再摄取阻滞药物丙咪嗪和氟西汀，表明该 5-羟色胺合成和再摄取，受不同因素。Unc-86-null 突变体 NSM 神经元也显示异常的突起，这表明 unc 86 调节这一进程中发挥的作用。
秀丽隐杆线虫 TRPV 离子通道调节化学感受神经元 5HT 生物合成。
5-羟色胺 (5HT) 是调节到不同的化学和物理刺激的行为和内分泌反应的关键信号分子。我们通过瞬时受体潜在 V (TRPV) 离子通道线虫中报告 5HT 生物合成特定单元格的规管。突变 TRPV 基因 osm-9 或 ocr 2 中显著下调 5HT 合成酶色氨酸羟化酶 (tph-1) serotonergic 化学感受神经元 ADF，但都没有这种突变基因的表达也双基因突变的这两个通道影响其他种类的 serotonergic 神经元。TRPV 基因表达 ADF 神经元中但不是在其它 serotonergic 的神经元，而单元格-自主调节神经元特异性转录程序行事。而在嗅觉神经元 OSM 9 和 OCR-2 功能则是依赖于 ODR 3 Galpha，ODR 3 或 ADF 神经元中表达的两种其他 Galpha 蛋白的活动不需要植 tph-1 的表达，因此不同的神经元的 TRPV 离子通道可能受不同的机制。CaMKII UNC 43 增益的函数突变部分取消下调的 tph 1 TRPV 突变体，从而 CaMKII 可能是 TRPV 信号的效应。中 TRPV 基因产生突变发育蠕虫 Dauer 阶段的逮捕。此发育缺陷是 daf-2/胰岛素神经内分泌信号减少的 5HT 投入的部分原因。
STIM1，基本和守恒店面式经营 Ca2 + 通道功能的组件。
店面式经营 Ca2 + (SOC) 渠道管理的许多细胞过程，但分子中的基础组件不好界定。利用 RNA 干扰 (RNAi)-基于屏幕改变 thapsigargin (TG) 的基因-依赖 Ca2 + 条目，我们发现伴在 SOC 涌入需要和保守的作用。RNAi 介导组合式的果蝇 S2 细胞伴大大降低 TG 依赖 Ca2 + 的条目。膜片钳记录显示几乎完全抑制果蝇 Ca2 + 释放激活 Ca2 + (裂纹) 当前人类 T 细胞中具有类似于恒温恒湿空调系统当前的生物物理特性。同样，人类的同系物 STIM1 组合式大大减少恒温恒湿空调系统通道 Jurkat T 细胞的活动。RNAi 介导组合式的 STIM1 抑制 TG 或激动剂依赖 Ca2 + 在人胚胎肾 293 或 SH SY5Y 细胞中的条目。相反，在人胚胎肾 293 细胞中 STIM1 的表达小幅增强 TG 诱导 Ca2 + 进入。我们建议 STIM1，无处不表达的蛋白质，到哺乳动物细胞从果蝇守恒 SOC 涌入中发挥重要作用，并可能是常见组件的 SOC 和恒温恒湿空调系统的渠道。
STIM1 是 Ca2 + 传感器，可激活恒温恒湿空调系统的渠道，并将从 Ca2 + 存储迁移到细胞质膜。
作为唯一 Ca2 + 进入机制在各种各样的非可兴奋性细胞，店面式经营钙 (SOC) 涌入是重要的 Ca2 + 信号和许多其他细胞的过程。T 淋巴细胞中的钙释放激活钙 (裂纹) 通道是 best-characterized SOC 涌入通道和免疫反应，持续开展活动所必需的基因表达及增殖的恒温恒湿空调系统渠道至关重要。分子的身份和 SOC 和恒温恒湿空调系统渠道门控机制仍难以捉摸。先前我们发现伴和哺乳动物同系物 STIM1 恒温恒湿空调系统通道激活在果蝇 S2 细胞和 T 淋巴细胞中的重要组成部分。在这里我们显示 EF 手伴或 STIM1 的突变体的表达激活恒温恒湿空调系统渠道一而无需更改 Ca2 + 存储内容。通过免疫荧光法、 EM 本地化和表面生物素我们显示 STIM1 从内质内质网样站点迁移到细胞质膜的 Ca2 + 耗竭后存储。我们建议作为缺少的一环之间 Ca2 + STIM1 函数存储消耗和 SOC 涌入，作为 translocates 等离子膜激活恒温恒湿空调系统频道存储耗尽后的 Ca2 + 传感器。
经大量涌入的全基因组 RNAi 屏幕标识规范经释放激活经通道活动的基因。
最近我们组和其他人的研究表明伴在店面式经营经大量涌入和经释放激活经 (裂纹) 通道活动所需和保守的作用。通过使用一个不带偏见的全基因组 RNA 干扰屏幕中果蝇 S2 细胞，我们现在确定强烈抑制经涌入后存储清空的 thapsigargin 的 75 命中。当中这些命中 11 预测的跨膜蛋白，包括伴，和一、 olf186-F、 对 RNA 干扰介导的组合式展示了深刻减少 thapsigargin 诱发经条目和恒温恒湿空调系统当前，和表达的恒温恒湿空调系统当前的三折扩增后。恒温恒湿空调系统电流进一步增加至 8-fold 高于控制和更迅速发展与伴 cotransfected olf186 F 是当。olf186-F 是从杆线虫对人类同源四跨膜跨越蛋白质高保守家庭的成员。内质网 (ER) 经泵萨尔-与 ER 钙 ATPase （SERCA） 和单跨膜可溶性 N ethylmaleimide 敏感 （NSF） 附件 （陷阱） 受体蛋白质 Syntaxin5 也是所需的恒温恒湿空调系统通道活动，符合其中伴感官经消耗在急诊室内的信号转导通路对细胞膜，translocates 和 olf186-F 到触发器恒温恒湿空调系统通道活动进行交互。
通过改变的离子选择性突变体的口语中的恒温恒湿空调系统通道的分子鉴定。
最近的 RNA 干扰屏幕已经确定是涌入商店经营 Ca2 + 和 Ca2 + 释放激活 Ca2 + 所必不可少的几种蛋白质 (裂纹) 通道活动在果蝇和哺乳动物，包括伴 (基质相互作用分子） 和口语的跨膜蛋白。伴可能充当鲁米那 Ca2 + 含量的传感器和触发后存储耗尽 Ca2 + 激活的恒温恒湿空调系统渠道中的表面膜。之间的口语 (也称为 olf186-F) 三种人类同系物，12 号染色体上的 ORAI1 被发现严重联合免疫缺陷病患者的突变和表达的野生型 Orai1 还原 Ca2 + 大量涌入和恒温恒湿空调系统通道活动病人 T 细胞。伴和在一起的口语表达明显增加了恒温恒湿空调系统电流。然而，它不尚未清楚伴或口语其实形成元信道，还是他们表达只是限制不同通道形成亚基介导的恒温恒湿空调系统通道活动。在这里我们显示处理 thapsigargin 诱使 Ca2 + 存储耗尽后大大增强野生型伴和口语，由 co-沉淀，评估之间的互动情况。通过定点突变，我们显示从谷氨酸在口语中守恒 S1 S2 循环的位置 180 天冬氨酸的基因点突变转换的恒温恒湿空调系统当前正在 Ca2 + 从离子选择性属性-选择性与外来校正被选择性的单价阳离子和外向整流。在相同的位置 (丙氨酸谷氨酸) 中电荷和突变充当显性负非导电亚基。其他中电荷和突变体在同一环路中的表示恒温恒湿空调大内心整流系统当前，和这些展品的两个通道阻滞剂 Gd3 + 敏感性降低。这些结果表明口语本身就构成了 Ca2 +-选择性过滤器的恒温恒湿空调系统通道。
恒温恒湿空调系统通道的分子基础。
经释放激活经 (裂纹) 通道，位于细胞质膜，打开后释放的经胞内存储，允许经入境和持续 [Ca(2+)](i) 信号补充的存储区中多种细胞类型。这种机制是特别重要的 T 淋巴细胞的免疫系统，提供缺少的一环，由 T 细胞受体参与发起并导致信号转导叶栅改变最终结果的基因的表达在生产中细胞因子和细胞增殖。过去三年，以及过量表达和定点突变 RNA 干扰屏幕已确定触发分子 （伴） 链接存储耗尽、 恒温恒湿空调系统通道介导经大量涌入和孔亚基 (口语) 的恒温恒湿空调系统通道的允许经离子具有高度选择性输入到单元格中。
Orai1 和 STIM1 移动到免疫突触后，上调在 T 细胞的活化过程。
高效开发的免疫反应，T 淋巴细胞需要长效钙涌入钙释放活性钙 (裂纹) 渠道和 (IS) 与抗原递呈细胞 (APC) 稳定免疫突触的形成。最近 RNAi 屏幕已查明伴和果蝇细胞中的口语和其相应哺乳动物同源 STIM1 和 Orai1 的 T 细胞，作为恒温恒湿空调系统通道激活的必要条件。在这里，我们显示 STIM1 和 Orai1 被征聘到主人类 T 细胞与自体树突状细胞的免疫突触。在休息或 super-antigen （SEB） 之间的联系方面积累了 STIM1 和 Orai1-预处理 T 细胞与 SEB 脉冲的树突状细胞，在他们被 colocalized 共刺激分子与 T 细胞受体 (TCR)。此外，在满载 EGTA T 细胞信号转导的细胞内钙成像大大透露高 Ca2 + 浓度附近接口，Ca2 + 大量涌入，该值指示在 T 细胞/树突状细胞接触面积本地化。Orai1 显性负突变体的表达阻止 T 细胞 Ca2 + 信号，但不是干涉的 STIM1、 Orai1 和接触区 CD3 初始积累。爆炸造成激活的 T 细胞，内源性 STIM1 和所有三种人类同源的口语表达是上调，同时 Ca2 + 通过恒温恒湿空调系统渠道流入显著增加。这些结果意味着积极的反馈回路的初始 TCR 信号看好 STIM1 上调和口语蛋白质会增加 Ca2 + 信号在随后抗原期间遇到。
存储依赖和独立模式调节 Ca2 + 释放激活 Ca2 + 通道活性的人类 Orai1 和 Orai3。
我们计算电流诱导人类同源的口语与 STIM1 在人胚肾细胞中的表达。当 co-expressed 与 STIM1，Orai1 感应电流大内心整流 Ca(2+) 选择性与 Ca(2+) 诱导慢灭活。Orai1 点突变 （E106D） 改变诱导经释放激活恒温恒湿空调经 (系统)-像同时保留内心纠正我的电流-V 特性的离子选择性。表达的 STIM1 与 Orai1 的 C 端部分，就足以生成恒温恒湿空调系统当前不存储耗尽的情况下。2 建业激活相对非选择性大电流在 STIM1 和 Orai3 转的单元格。2 建业也诱导的经涌入 Orai3 表示的单元格，而不存储耗尽或 STIM1 的共表达。Orai3 当前诱导 2 建业展出外向整流和代表混合的钙和单价当前外来成分。Orai3 孔突变抑制店面式经营经入境和没有响应存储耗尽或增加 2 建业携带大量电流。一系列的 Orai1-3 嵌合体的分析表明负责 2-建业诱导当前序列中从第二到第三跨膜段的 Orai3 结构的决定因素。致 2 建业 Orai3 当前可能反映打开相对非选择性阳离子孔隙的恒温恒湿空调系统通道激活独立于存储的模式。
元信道组成的四聚体形成的诱导伴口语二聚体二聚反应。
Ca(2+) 释放激活经 (裂纹) 渠道基础持续经信号中淋巴细胞和无数其他细胞内质网 (ER) 从解放后经。RNA 干扰技术筛选方法确定两种蛋白，伴和口语，共同形成恒温恒湿空调系统通道活动的分子基础。伴感官 ER 经存储消耗和物理方式将此信息中继由从急诊室到路口毗邻等离子膜、 转运和口语体现了细胞膜钙通道的毛孔。伴和口语，co 沉淀和 Förster 共振能量转移，确定之间的密切互动参与由口语亚基组成的经通道开放。大多数的离子通道是串联体的孔隙形成围绕中央的通道，它是在急诊室中预装和运输，其最后的化学计量比对等离子膜蛋白亚基。我们在这里展示通过交联在完好的细胞和细胞裂解后的生化分析和不交联、 口语主要二聚体在细胞膜在静息条件下的情况下使用非变性凝胶电泳。此外，单分子成像的绿色荧光蛋白 (GFP)-在非洲爪蟾卵母细胞中表达的标记的口语主要是表明两步光漂白，再次符合二聚基底状态。相比之下，伴胞浆蛋白作为激活口语通道无诱导经存储耗尽或成 punctae 聚类的口语的羧基总站与共的绿色荧光蛋白标记的口语表达产生了大多是四步漂白，符合 tetrameric 化学计量学的口语活动通道。伴 C 总站相互作用从而诱使口语二聚体，dimerize，形成四聚物状态构成 Ca(2+) 选择性的孔隙。这是一个新的机制，其中大会和激活的功能离子通道介导的触发的分子。
特发性肺动脉高压与关联 TRPC6 基因启动子功能单核苷酸多态性。
过度扩散的肺动脉平滑肌细胞 (肺动脉) 重要作用特发性肺动脉高压 (IPAH) 的发展而胞浆 Ca2 + 浓度上升触发 PASMC 收缩，并刺激 PASMC 扩散。最近，我们展示了这上调 TRPC6 通道有助于 IPAH 临床分离与肺动脉的扩散。TRPC6 基因启动子与 IPAH 关联且具有功能意义在规管与肺动脉 TRPC6 活动中，这项研究试图确定单核苷酸多态性 (SNPs)。
Mzb1 蛋白质调节钙稳态、 抗体分泌和整合素活化的先天样 B 细胞。
脾边缘区 (MZ) B 单元格和单元格 B1，被称为天生样 B 细胞，由他们减毒的经动员、 快速抗体分泌和增加的细胞粘附从滤泡 B 细胞不同。我们发现，并作为最清楚有人 MZ B 和 B1 单元格中的内质网本地化和 B 细胞特异性蛋白的特点 Mzb1。⑷ Mzb1 MZ B 细胞增加经动员和核 NFAT 转录因子本地化，但减少了脂多糖诱导抗体分泌和整合素介导的细胞粘附。相反，荔枝 Mzb1 转基因在外周血 T 细胞的异位表达导致减毒经调动和增强整合素介导的细胞粘附。除了其与特定于衬底的伴侣 Grp94 的互动，Mzb1 增强有利于整合素表达的其活性构象中的 ERp57 氧化还原酶的作用。因此，Mzb1 有助于使外周血 B 细胞功能多样化通过调节经商店、 抗体分泌和整合素激活。
Orai1 跨膜段 1 基因突变导致的 Orai1 频道在甘氨酸 98 STIM1 独立激活和精氨酸 91 在明渠截流。
伴和口语的蛋白质包括经释放激活经 (裂纹) 通道的分子机制。理解浇注 Orai1 渠道的一种办法，我们调查的第一次跨膜段 (原肌球蛋白 1) 两个守恒地点选定突变的影响： 精氨酸 91 位于附近的原肌球蛋白 1 和甘氨酸 98 附近的原肌球蛋白 1 中间游离结束。Orai1 R91C，当 coexpressed 与 STIM1，Ca(2+) 存储消耗通常被激活。酰胺，巯基氧化剂，治疗诱导形成的二硫键之间中相邻的 Orai1 亚基 R91C 残留和迅速阻止 STIM1 经营经电流。酰胺诱导阻塞，扭转了二硫化债券减水剂。这些结果表明 R91 很窄的一部分进行毛孔胞浆侧。丙氨酸更换，G98 阻止 STIM1 诱导通道活动。有趣的是，天冬氨酸 (G98D) 或脯氨酸 (G98P) 突变造成本构通道激活 STIM1 独立的方式。这两个 Orai1 G98 突变体形成非选择性的 Ca(2+) 透电导是相对抗的 Gd(3+) 阻止。双突变体 R91W/G98D 也是一活动，克服由色氨酸的发现一些患者严重联合免疫缺陷 (SCID) 的 91 位置的正常通道活动的抑制作用，R91C/G98D 双突变是耐酰胺块。这些数据表明通道孔扩阔和突变的 G98 站点，可能会干扰 α 螺旋结构改变离子选择性。我们建议不同的职能作用为 G98 作为浇注铰链和 R91 作为物理大门通道窄口内的一部分。
在探索的信号转导通路的品种全基因组 RNAi 屏幕的应用程序。
心血管发展是在黯淡的精确协调的过程。它涉及到众多的信号转导途径，以确保适当的细胞极性、 迁移、 增殖、 分化和编程性的死亡之间跨浅。在这里，作为新型的办法，以发现潜在的监管机构，特别重点 (1) 细胞生长和生存能力和 (2) 受体酪氨酸激酶和胞外信号调节激酶信号转导通路与全基因组 RNA 干扰屏幕在果蝇细胞中的引入了。
