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Articles by Shenyuan Zhang in JoVE
JoVE General
Purificazione del DNA plasmidi da colonie batteriche Utilizzando il kit Qiagen Miniprep
Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine (UCI)
Other articles by Shenyuan Zhang on PubMed
Il C. Elegans, Fattore Di Trascrizione POU-dominio UNC-86 Regola Il Tph-1 Triptofano Idrossilasi Gene E Dei Neuriti Escrescenza Nei Neuroni Serotoninergici Specifici
Una questione fondamentale in neurobiologia dello sviluppo è come un comune neurotrasmettitore è specificato in diversi tipi neuronali?. Descriviamo la cellula-specifico regolamento del fenotipo serotoninergici dal c. elegans, fattore di trascrizione POU UNC-86. Mostriamo che unc-86 regola aspetti peculiari dell'identità neuronale terminale in quattro classi di neuroni serotoninergici, ma che lo sviluppo dei neuroni serotoninergici ADF è regolato da un programma di UNC-86-indipendenti. Nei neuroni NSM, il ruolo di unc-86 è confinato nella differenziazione tardiva; i neuroni sono generati ma non esprimono geni necessari per neurotrasmettitori serotoninergici. UNC-86-null mutazioni possono influenzare l'espressione in NSM di tph-1, che codifica per la serotonina sintetica enzima triptofano idrossilasi, e cat-1, che codifica per un trasportatore vescicolare che carica la serotonina in vescicole sinaptiche, suggerendo che unc-86 coordinately regola la sintesi di serotonina e di confezionamento. Tuttavia, le mutazioni unc-86-null non compromettere la capacità di NSM di reuptake della serotonina rilasciata da neuroni chemosensory serotoninergici ADF e della ricaptazione della serotonina è sensibile alla serotonina reuptake blocco farmaci imipramina e fluoxetina, dimostrando quella sintesi di serotonina e reuptake è regolato da fattori distinti. I neuroni NSM unc-86-null mutanti anche visualizzare escrescenza anormale dei neuriti, suggerendo un ruolo di unc-86 nel regolare questo processo pure.
Canale Ionico Caenorhabditis Elegans TRV1 Regola La Biosintesi Di 5HT Nei Neuroni Chemosensory
Serotonina (5HT) è una molecola di segnalazione cardine che modula le risposte comportamentali ed endocrine a diversi stimoli chimici e fisici. Riportiamo-specifico regolamento della 5HT biosintesi di potenziali canali ionici V (TRV1) transient receptor, in c. elegans. Mutazioni nei geni TRV1 osm-9 o ocr-2 drammaticamente sottoregola l'espressione del gene che codifica la 5HT sintesi enzima triptofano idrossilasi (tph-1) nei neuroni serotoninergici chemosensory ADF, ma né la mutazione né la doppia mutazione di entrambi i geni canale influisce su altri tipi di neuroni serotoninergici. I geni TRV1 sono espressi nei neuroni ADF, ma non in altri neuroni serotoninergici e agiscono cella-autonomamente per regolare un programma specifico del neurone trascrizione. Considerando che nei neuroni olfattivi OSM-9 e OCR-2 la funzione è dipendente da ODR-3 Galpha, l'attività di ODR-3 o due altre proteine Galpha espressi nei neuroni ADF non è richiesto per upregulating tph-1 espressione, così i canali ionici TRV1 nei neuroni differenti potrebbero essere regolamentati da meccanismi differenti. Una mutazione di guadagno di funzione CaMKII UNC-43 parzialmente sopprime la downregulation del tph-1 i mutanti TRV1, CaMKII può quindi essere un effector del segnale TRV1. Mutazioni nella causa di geni TRV1 Worm inerente allo sviluppo arresto nella fase Dauer. Questo difetto dello sviluppo è dovuto in parte al ridotto 5HT inputs nella segnalazione neuroendocrini daf-2/insulina.
STIM1, Un Componente Essenziale E Conservato Di Archivio Gestito Di Funzione Canale Ca2 +
Archivio-operati Ca2 + canali (SOC) regolano molti processi cellulari, ma i componenti molecolari sottostanti non sono ben definiti. Utilizzando un'interferenza del RNA (RNAi) - basato su schermo per identificare i geni che alterano thapsigargin (TG) - voce di Ca2 + dipendenti, abbiamo scoperto un ruolo richiesto e conservato di Stim in afflusso SOC. RNAi-mediata atterramento di Stim in drosofila S2 cellule significativamente ridotta TG-dipendenti Ca2 + voce. Registrazione di patch-clamp ha rivelato quasi completa soppressione del drosofila Ca2 + attivato dal rilascio Ca2 + corrente (CRAC) che ha caratteristiche biofisiche simile al CRAC corrente nelle cellule T umane. Analogamente, atterramento dell'omologo umano STIM1 significativamente ridotta attività del canale CRAC in cellule Jurkat T. RNAi-mediata atterramento di STIM1 inibito TG-agonista-dipendente Ca2 + entrata nelle cellule HEK293 o SH-SY5Y. Al contrario, sovraespressione di STIM1 nelle cellule HEK293 enhanced modestamente TG-induced Ca2 + voce. Proponiamo che STIM1, una proteina ubiquitously espressa che è conservata da Drosofila in cellule di mammifero, gioca un ruolo essenziale nell'afflusso SOC e può essere un componente comune dei canali SOC e CRAC.
STIM1 è Un Sensore Di Ca2 + Che Attiva I Canali CRAC E Migra Dal Deposito Di Ca2 + Nella Membrana Del Plasma
Come il solo Ca2 + meccanismo di voce in una varietà di cellule non eccitabili, afflusso di calcio store-operato (SOC) è importante in Ca2 + segnalazione e molti altri processi cellulari. Un canale di calcio calcio-comunicato-attivato (CRAC) in linfociti T è il canale di afflusso SOC best-characterized ed è essenziale per la risposta immunitaria, sostenuta attività di canali CRAC essendo necessaria per la proliferazione e l'espressione genica. L'identità molecolare e il meccanismo di controllo dei canali SOC e CRAC sono rimasti sfuggente. In precedenza abbiamo identificato Stim e l'omologo mammifero STIM1 come componenti essenziali di attivazione canale CRAC in drosofila S2 cellule e linfociti T umani. Qui ci mostra che l'espressione dei mutanti di EF-mano di Stim o STIM1 attiva i canali CRAC costitutivamente senza cambiare negozio contenuto di Ca2 +. Immunofluorescenza, localizzazione di EM e superficie biotinylation che mostriamo che STIM1 migra da endoplasmic-reticolo-come siti di membrana del plasma all'esaurimento del Ca2 + store. Proponiamo che STIM1 funzioni come l'anello mancante tra Ca2 + negozio deplezione e SOC afflusso, che serve come un sensore di Ca2 + che trasloca al negozio deplezione di membrana del plasma per attivare canali di CRAC.
Genome-wide Screen RNAi Di Afflusso Ca(2+) Identifica I Geni Che Regolano L'attività Del Canale Ca(2+) Ca(2+) Attivato Dal Rilascio
Recenti studi dal nostro gruppo e altri hanno dimostrato un ruolo richiesto e conservato di Stim nel negozio gestito Ca(2+) afflusso e attività del canale Ca(2+) (CRAC) attivato dal rilascio Ca(2+). Utilizzando un imparziale schermo di interferenza del RNA genome-wide in cellule di Drosophila S2, identifichiamo ora 75 hits che fortemente inibito Ca(2+) afflusso al negozio lo svuotamento da thapsigargin. Tra questi successi sono 11 proteine transmembrana predetta, tra cui Stim e uno, olf186-F, che su RNA interferenza-mediata atterramento esposto una profonda riduzione delle thapsigargin evocato Ca(2+) voce e CRAC corrente e su sovraespressione un triplice aumento del CRAC corrente. CRAC correnti sono state ulteriormente aumentate a ad superiori di controllo e si è sviluppato più velocemente quando era cotransfected olf186-F con Stim. olf186-F è un membro di una famiglia altamente conservata del quattro-transmembrane spanning proteine con omologhi da Caenorhabditis elegans di umani. Il reticolo endoplasmatico (ER) Ca(2+) pompa sarco- / ER Calcio ATPasi (SERCA) e la proteina recettore (rullante) allegato N-ethylmaleimide-sensibili (NSF) transmembrana solubile singola Syntaxin5 inoltre erano necessari per attività del canale CRAC, coerente con una via di segnalazione in cui Stim i sensi Ca(2+) esaurimento entro l'ER, trasloca a membrana del plasma e interagisce con olf186-F a trigger CRAC canale attività.
Identificazione Molecolare Del Canale CRAC Di Selettività Dello Ione Alterato in Un Mutante Di Orai
Schermi di interferenza RNA recenti hanno identificato diverse proteine che sono essenziali per negozio-operati Ca2 + afflusso e Ca2 + attivato dal rilascio Ca2 + attività del canale (CRAC) in Drosophila e nei mammiferi, tra cui le proteine transmembrane Stim (molecola di interazione stromale) e Orai. Stim probabilmente funziona come un sensore di luminal Ca2 + contenuto e innesca l'attivazione dei canali CRAC nella membrana superficiale dopo il negozio di deplezione di Ca2 +. Tra i tre umani omologhi di Orai (noto anche come olf186-F), ORAI1 sul cromosoma 12 è stato trovato per essere mutato in pazienti affetti da immunodeficienza combinata grave, ed espressione del selvaggio-tipo Orai1 restaurato Ca2 + afflusso e attività del canale CRAC nel paziente cellule T. La sovraespressione di Stim e Orai insieme aumenta marcatamente CRAC corrente. Tuttavia, non è ancora chiaro se Stim o Orai in realtà costituisce il canale CRAC, o se la loro espressione limita semplicemente CRAC canale attività mediata da una subunità che formano canali differente. Qui ci mostra che l'interazione tra il selvaggio-tipo Stim e Orai, valutato da co-immunoprecipitazione, è notevolmente migliorato dopo trattamento con thapsigargin per indurre il negozio deplezione di Ca2 +. Da mutagenesi luogo-diretta, ci mostra che una mutazione puntiforme da glutammato di aspartato nella posizione 180 nel ciclo S1-S2 conservato dell'Orai trasforma le proprietà di selettività dello ione di corrente da essere Ca2 + CRAC-selettiva con rettificazione interiore ad essere selettivi per cationi monovalenti e rettifica esteriormente. Una carica-neutralizzante mutazione nella stessa posizione (glutammato di alanina) agisce come una subunità non conduttore dominante-negativo. Altri mutanti carica-neutralizzante nel ciclo stesso esprimono grandi CRAC interiormente rettifica attuale, e due di questi esposizione ridotta sensibilità all'antagonista Gd3 +. Questi risultati indicano che Orai si formi il Ca2 +-filtro di selettività del canale CRAC.
Basi Molecolari Del Canale CRAC
CA(2+) attivato dal rilascio Ca(2+) (CRAC) canali, che si trova nella membrana del plasma, sono aperti dopo il rilascio di Ca(2+) dai depositi intracellulari, permettendo Ca(2+) voce e sostenuta [Ca(2+)](i) segnalazione che riempie il negozio in numerosi tipi di cellule. Questo meccanismo è particolarmente importante nei linfociti T del sistema immunitario, che forniscono il collegamento mancante nella cascata di trasduzione del segnale viene avviato dall'impegno del recettore delle cellule T, che conduce alla alterata espressione dei geni che si traduce in definitiva la produzione di citochine e delle cellule di proliferazione. Negli ultimi tre anni, gli schermi di interferenza RNA insieme con sovraespressione e mutagenesi luogo-diretta hanno identificato la molecola scatenante (Stim) che link negozio deplezione di CRAC canale-mediata Ca(2+) afflusso e la subunità poro (Orai) del canale CRAC che permette l'ingresso altamente selettivo di ioni Ca(2+) in cellule.
Orai1 E STIM1 Spostare La Sinapsi Immunologica E Sono Up-regolate Durante L'attivazione Delle Cellule T
Per uno sviluppo efficiente di una risposta immunitaria, i linfociti T richiedono duraturo afflusso di calcio attraverso i canali di calcio calcio attivato dal rilascio (CRAC) e la formazione di una sinapsi immunologica stabile (IS) con le cellule presentanti l'antigene (APC). Schermi RNAi recenti hanno identificato Stim e Orai nelle cellule di Drosophila e loro corrispondenti omologhi dei mammiferi STIM1 e Orai1 in cellule T, come essenziale per l'attivazione del canale CRAC. Qui, ci mostra che STIM1 e Orai1 sono reclutati per la sinapsi immunologica tra primarie umane delle cellule T e cellule dendritiche autologhe. STIM1 sia Orai1 accumulato nella zona di contatto tra riposo o super-antigen (SEB)-pretrattati cellule T e cellule dendritiche SEB-pulsato, dove essi erano colocalized con il recettore delle cellule T (TCR) e molecole di costimolazione. Inoltre, imaging del calcio intracellulare segnalazione in cellule T caricate con EGTA ha rivelato significativamente superiore Ca2 + concentrazione vicino l'interfaccia, che indica Ca2 + afflusso localizzata presso l'area di contatto delle cellule dendritiche/T cell. Espressione di un mutante Orai1 dominante-negativo bloccato T cell Ca2 + segnalazione ma non ha interferito con l'accumulazione iniziale di STIM1, Orai1 e CD3 nella zona di Contatta. Nelle cellule T attivate blasti, espressione del mRNA per STIM1 endogeni e tutti i tre umani omologhi di Orai era up-regolato, accompagnato da un marcato aumento nell'afflusso Ca2 + attraverso i canali CRAC. Questi risultati implicano un ciclo di feedback positivo, in cui un segnale iniziale TCR favorisce la up-regulation di STIM1 e Orai proteine che vuoi aumentare Ca2 + segnalazione durante successive antigene incontro.
Modalità Store-dipendente E - Indipendenti Che Regolano Ca2 + Attivato Dal Rilascio Ca2 + Canale Attività Di Orai1 Umano E Orai3
Abbiamo valutato le correnti indotte dall'espressione di umane omologhi di Orai insieme STIM1 in cellule renali embrionali umane. Quando co-expressed con STIM1, Orai1 indotta da una grande corrente interiormente rettifica Ca(2+)-selettiva con inattivazione lenta Ca(2+)-indotta. Una mutazione puntiforme del Orai1 (E106D) alterato la selettività dello ione di indotta Ca(2+) attivato dal rilascio caratteristica di Ca(2+) (CRAC) - come corrente mantenendo un interiormente che rettifica I - V. Espressione della porzione C-terminale del STIM1 con Orai1 era sufficiente per generare corrente senza negozio deplezione CRAC. 2-APB attivato una grande corrente relativamente selettivo nelle cellule co-expressing STIM1 e Orai3. 2-APB Ca(2+) afflusso anche indotta in cellule che esprimono Orai3 senza negozio deplezione o co-expression di STIM1. La corrente di Orai3 indotta da 2-APB esposto rettifica verso l'esterno e una componente interiore che rappresenta un misto di calcio e monovalente corrente. Un mutante del poro di Orai3 inibito operati dal negozio Ca(2+) voce e non ha fatto trasportare corrente significativo in risposta a negozio di esaurimento o aggiunta di 2-APB. Analisi di una serie di Orai1-3 chimere rivelato determinante strutturale responsabile della corrente 2-APB-indotta all'interno della sequenza dal secondo al terzo segmento transmembrana di Orai3. La corrente di Orai3 indotta da 2-APB potrebbe riflettere una modalità indipendente dal negozio di attivazione canale CRAC che apre un poro cazione relativamente non selettivi.
Il Canale CRAC è Costituito Da Un Tetramero Formato Da Stim-indotta Di Dimerizzazione Di Dimeri Orai
CA(2+)-rilascio-attivato canali Ca(2+) (CRAC) sottostanno sostenuta Ca(2+) segnalazione nei linfociti e numerose altre cellule dopo la liberazione di Ca(2+) dal reticolo endoplasmatico (ER). RNA interference approcci di screening identificato due proteine, Stim e Orai, che insieme formano la base molecolare per attività del canale CRAC. Stim senses deplezione del negozio ER Ca(2+) e fisicamente inoltra questa informazione da translocating da ER per giunzioni adiacente alla membrana del plasma, e Orai incarna il poro del canale del calcio della membrana plasmatica. Una stretta interazione tra Stim e Orai, identificato da co-immunoprecipitazione e dal trasferimento di energia per risonanza, è coinvolto nell'apertura del canale Ca(2+) formato da subunità Orai. La maggior parte dei canali ionici sono multimeri di poro-formazione delle subunità che circondano un canale centrale, che sono preassemblati in ER e trasportati nella loro stechiometria finale alla membrana del plasma. Qui vi mostriamo, da analisi biochimica dopo cross-linking in cellule intatte e lisati cellulari e tramite elettroforesi su gel non denaturante senza cross-linking, che Orai è principalmente un dimero nella membrana del plasma in condizioni di riposo. Inoltre, imaging di singola molecola della proteina fluorescente verde (GFP)-tagged Orai espressa in ovociti di Xenopus ha mostrato principalmente in due fasi photobleaching, ancora una volta coerente con uno stato basale dimerica. Al contrario, co-expression di Orai GFP-etichettato con il capolinea di carboxy della Stim come una proteina citosolica per attivare il canale Orai senza indurre deplezione negozio Ca(2+) o clustering di Orai in punctae ceduto principalmente quattro fasi photobleaching, coerente con una stechiometria tetramerica del canale attivo Orai. Interazione con il C-terminale di Stim induce così Orai dimeri a dimerize, formando tetrameri che costituiscono il poro Ca(2+)-selettivo. Questo rappresenta un nuovo meccanismo in cui montaggio e attivazione del canale ionico funzionali sono mediati dalla stessa molecola scatenante.
Un Funzionale Polimorfismo a Singolo Nucleotide Nel Promotore Gene TRPC6 Associato Con Ipertensione Arteriosa Polmonare Idiopatica
Eccessiva proliferazione di cellule muscolari lisce di arteria polmonare (PASMCs) svolge un ruolo importante nello sviluppo dell'ipertensione arteriosa polmonare idiopatica (IPAH), considerando che un aumento della concentrazione di Ca2 + citosolico attiva contrazione PASMC e stimola la proliferazione PASMC. Recentemente, abbiamo dimostrato che sovraregolazione di TRPC6 canale contribuisce alla proliferazione di PASMCs isolati da pazienti con IPAH. Questo studio ha cercato di identificare i polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) nel promotore del gene TRPC6 che sono associati con IPAH e hanno un significato funzionale nella regolazione della attività TRPC6 in PASMCs.
Mzb1 Proteina Regola L'omeostasi Del Calcio, La Secrezione Di Anticorpi E Attivazione Di Integrina Nell'innata-come Le Cellule B
Zona marginale (MZ) B cellule della milza e le cellule B1, definito innata-come le cellule B, differiscono dalle cellule B follicolare da loro mobilitazione Ca(2+) attenuato e secrezione dell'anticorpo veloce adesione aumentata delle cellule. Abbiamo identificato e caratterizzato Mzb1 come una proteina localizzata del reticolo endoplasmatico e specifiche delle cellule di B che è stato più abbondantemente espresso nelle cellule MZ B e B1. Atterramento di Mzb1 in cellule B MZ Ca(2+) mobilizzazione e localizzazione di fattore di trascrizione NFAT nucleare è aumentato, ma ridotta secrezione anticorpale indotta dal lipopolisaccaride e adesione integrina-mediata delle cellule. Al contrario, espressione ectopica di un transgene Lck-Mzb1 a cellule T periferiche portato attenuato Ca(2+) mobilizzazione e aumentata adesione integrina-mediata delle cellule. Oltre alla sua interazione con il substrato specifico chaperone Grp94, Mzb1 aumentata la funzione dell'ossidoriduttasi ERp57 in favorendo l'espressione delle integrine nella loro conformazione attivata. Così, Mzb1 aiuta a diversificare le funzioni delle cellule B periferiche regolando Ca(2+) negozi, secrezione di anticorpi e attivazione di integrina.
Mutazioni Nel Segmento Del Transmembrane Orai1 1 Causa Attivazione STIM1 Indipendente Dei Canali Orai1 a Glicina 98 E Chiusura Canale All'arginina 91
Stim e Orai proteine comprendono macchine molecolari dei canali Ca(2+) (CRAC) attivato dal rilascio di Ca(2+). Come un approccio verso la comprensione del gating dei canali Orai1, abbiamo studiato gli effetti delle mutazioni selezionati in due siti, conservate nel primo segmento del transmembrane (TM1): arginina 91 situato vicino all'estremità citosolico del TM1 e glicina 98 vicino al centro di TM1. R91C Orai1, quando coespressi con STIM1, è stata attivata normalmente da deplezione Ca(2+)-store. Trattamento con diammide, un agente ossidante tiolo, induce la formazione di ponti disolfuro tra residui di R91C nella subunità Orai1 adiacente e rapidamente bloccato STIM1 operati Ca(2+) corrente. Diammide-indotta di blocco è stato stornato dagli agenti di riduzione del legame disolfuro. Questi risultati indicano che R91 costituisce una parte molto ristretta del poro condotta sul lato citosolico. Sostituzione dell'alanina a G98 impedito attività del canale STIM1-indotta. È interessante notare che, mutazione di aspartato (G98D) o prolina (G98P) causato attivazione costitutiva di canale in modo indipendente dal STIM1. Entrambi mutanti Orai1 G98 formano una conduttanza permeabile Ca(2+) non selettivo che era relativamente resistente al blocco di Gd(3+). Il doppio mutante R91W/G98D fu anche costitutivamente attive, superando la normale inibizione dell'attività del canale di triptofano in posizione 91 trovato in alcuni pazienti con immunodeficienza combinata grave (SCID), e il doppio mutante R91C/G98D resistente al blocco diammide. Questi dati suggeriscono che il poro del canale è allargato e selettività dello ione è alterata da mutazioni al sito G98 che possono perturbare la struttura α-elicoidale. Proponiamo distinti ruoli funzionali per G98 come un controllo cerniera e R91 come parte della fisica porta alla stretta bocca interna del canale.
L'applicazione Di Schermi RNAi Genome-wide Nell'esplorare La Varietà Di Vie Di Trasduzione Di Segnalazione
Sviluppo cardiovascolare è un processo coordinato precisamente a multilevels. Si tratta di cross-talking tra numerose vie di trasduzione del segnale affinché la polarità corretta cella, migrazione, proliferazione, differenziazione e morte programmata. Qui, schermi di interferenza RNA genome-wide in cellule di Drosophila sono introdotti come nuovi approcci per scoprire potenziali erogatori, con speciale enfasi sulla cella (1) crescita e redditività e (2) del recettore tirosina chinasi e chinasi extracellulare-segnale-regolate signaling pathway.
