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Articles by Srikumar Sengupta in JoVE
JoVE General
Leggi singolo e accoppiamento finale mRNA-Seq Biblioteche Illumina da 10 nanogrammi di RNA totale
1Regenerative Biology, Morgridge Institute for Research, 2Department of Cell & Regenerative Biology, University of Wisconsin, 3Department of Molecular, Cellular, & Regenerative Biology, University of California
Qui si descrive un metodo per la preparazione di entrambi i singoli letti e associato fine Illumina mRNA-Seq librerie sequenziamento per l'analisi di espressione genica basata su amplificazione lineare dell'RNA T7. Questo protocollo richiede solo 10 nanogrammi di RNA totale di partenza e genera librerie altamente coerente rappresentanza trascrizioni intero.
Other articles by Srikumar Sengupta on PubMed
Rilevazione Molecolare E Identificazione Del Virus Dell'influenza Di Ibridazione Di Microarray Di Oligonucleotidi
Microarray di oligonucleotidi specifici per il virus può fornire un metodo di screening contemporaneamente campioni per la presenza o l'assenza di una grande varietà di virus. Virus influenzali sono ideali per valutare tali microarrays a causa della loro genetica e diversità di host e la disponibilità di un database esteso di sequenza. Una collezione di 476 oligonucleotidi di specifici per il virus influenzale è stata avvistata su vetrini come sonde. RNAs virale erano inverso trascritto e amplificato mediante PCR, e i prodotti sono stati etichettati con cianina coloranti. La presenza di virus e le loro identità sono stati determinati tramite l'ibridazione. Le intensità di fluorescenza di macchie del oligonucleotide sono stati soddisfacentemente proporzionale tra esperimenti e altamente riproducibile all'interno di ciascuna diapositiva. Tuttavia, l'intensità delle macchie sonda completamente complementari alle sequenze bersaglio varia da sfondo alla saturazione. Le variazioni di non correlare con composizione base, sequenza nucleotidica o strutture secondarie interne. Pertanto, le soglie per determinare se l'ibridazione ad un posto dovrebbe essere giudicato come positivo sono state assegnate individualmente. Solo considerando positivi macchie da sonde predisse essere monocolturali per specie di virus dell'influenza, sottotipo, origine dell'host o segmento di gene, questo metodo fatto corrette identificazioni presso la specie, sottotipo emagglutinina e livelli di segmento del gene. Sonde di sottotipo monocolturali neuraminidasi (NA) erano sufficientemente diversificate per consentire l'assegnazione di sottotipo NA fiducioso. Incorporando i punti positivi da polispecifico sonde nel regime di identificazione ha dato risultati simili. Nel complesso, i risultati dimostrano il potenziale dell'ibridazione del oligonucleotide basata su microarray per la rilevazione dei virus più.
Genome-wide Expression Profiling Rivela Associate All'EBV Inibizione Di MHC Di Classe I Espressione Nel Carcinoma Nasofaringeo
Per identificare i meccanismi molecolari da cui tumori epiteliali associate all'EBV sono mantenute, abbiamo misurato l'espressione di sostanzialmente tutti i geni umani e di tutti i geni latenti di EBV in una raccolta di 31 laser-catturato, campioni di tessuto microdissected carcinoma nasofaringeo (NPC) e 10 tessuti normali nasofaringei. Profili di espressione genica globale chiaramente distinguono i tumori da normale epitelio sano. I livelli di espressione di geni virali sei (EBNA1, EBNA2, EBNA3A, EBNA3B, LMP1 e LMP2A) sono stati correlati tra loro e fortemente inversamente correlati con l'espressione di un grande sottoinsieme dei geni di host. Tra i geni umani cui inibizione è stata più fortemente correlata con aumentata espressione di gene di EBV sono stati più MHC di classe I geni HLA coinvolto nella regolazione della risposta immunitaria tramite presentazione dell'antigene. L'associazione tra l'espressione di gene EBV e inibizione di MHC di classe I espressione HLA implica che display antigene è inibito o direttamente da EBV, agevolare l'evasione immune dalle cellule del tumore, o che le cellule tumorali con presentazione inibito sono selezionate per la loro capacità di sostenere più alti livelli di EBV per trarre il massimo vantaggio delle azioni di promozione tumorale mediata del oncogene EBV. I nostri dati riflettono chiaramente tale promozione tumorale, mostrando che la deregolamentazione delle proteine chiave coinvolti nell'apoptosi (proteine correlate a BCL2 A1 e molecola inibitoria apoptotic Fas), Checkpoint del ciclo cellulare (AKIP, SCYL1 e NIN), e metastasi (matrix metalloproteinase 1) sono strettamente correlato con i livelli di espressione di gene di EBV in NPC.
Geni Coinvolti Nella Riparazione Del DNA E Metabolismo Nitrosamina E Quelli Situati Sul Cromosoma 14q32 Sono in Carcinoma Nasofaringeo
Polimorfismi nel metabolismo nitrosamina, riparazione del DNA e geni di risposta immunitaria sono stati associati con carcinoma nasofaringeo (NPC). Studi hanno suggerito che regioni cromosomiche coinvolte in NPC. Per fare luce sull'eziologia NPC, abbiamo valutato host gene expression patterns in 31 NPC e 10 campioni di tessuto rinofaringeo normale utilizzo Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 matrice. Ci siamo concentrati sui geni in cinque a priori percorsi biologici e le posizioni cromosomiche. Tariffe di espressione differenziale all'interno di questi specificata liste e nel complesso sono stati testati utilizzando un metodo bootstrap. Espressione differenziale è stata osservata per il 7,6% dei set di sonda in generale. Sono stati osservati aumenti nel prezzo dell'espressione differenziale all'interno della riparazione del DNA (13,7%; P = 0.01) e metabolismo nitrosamina (17,5%; P = 0,04) percorsi. Sonda differenzialmente espresso imposta all'interno del percorso di riparazione del DNA sono stati costantemente overexpressed (93%), con forti effetti osservati per PRKDC, PCNA e CHEK1. Sonda differenzialmente espresso imposta all'interno del percorso del metabolismo nitrosamina erano costantemente underexpressed (100%), con forti effetti osservati per NQ01, CYP2B6 e CYP2E1. Nessuna prova significativa dell'aumento nel tasso di espressione differenziale è stato visto all'interno del percorso immunitario/infiammatorio. Un'elevazione significativa nel tasso di espressione differenziale è stata notata per cromosoma 4p15.1-4q12 (13,0%; P = 0,04); sia sovraespressione e underexpression erano evidenti (38% e il 62%, rispettivamente). Un'elevazione del tasso di espressione differenziale sul cromosoma 14q32 è stata osservata (11,3%; P = 0,06) con un modello coerenza di underexpression gene (100%; P < 0.0001). Questi effetti erano simili, se si escludono i tumori di stadio avanzato. I nostri risultati suggeriscono che l'attivazione nitrosamina e riparazione del DNA sono importanti in NPC. La coerente down-regulation dell'espressione sul cromosoma 14q32 suggerisce perdita di eterozigosi in questa regione.
Differenze Fondamentali Nel Ciclo Cellulare Deregulation in Human Papillomavirus-positivo E Umano Papillomavirus-negativi Testa/collo E Tumori Della Cervice Uterina
Papillomavirus umano (HPV) sono associati con quasi tutti i tumori della cervice uterina, 20% al 30% di testa e collo tumori (HNC) e di altri tumori. Perché HNCs sorgono anche in pazienti HPV negativo, questo tipo di cancro offre opportunità uniche per definire le somiglianze e le differenze di HPV-positivi contro HPV negativo tumori derivanti del tessuto stesso. Qui, descriviamo genome-wide expression profiling di 84 HNCs, tumori della cervice uterina e campioni epiteliali normale corrispondenza sito in cui abbiamo utilizzato microdissection del laser per arricchire i campioni per tumore derivato rispetto a cellule epiteliali normali. Questa analisi ha rivelato che HNCs HPV(+) e tumori cervicali differiscono nel loro pattern di espressione genica ancora condiviso molti cambiamenti rispetto al HNCs HPV(-). Alcuni di questi cambiamenti condivisi sono stati previsti, ma molti altri non lo erano. In particolare, HPV(+) HNCs e tumori della cervice uterina sono stati trovati per essere up-regolati nella loro espressione di un sottoinsieme distinto e più grande del ciclo delle cellule geni rispetto a quello osservato in HNC HPV(-). Inoltre, HPV(+) tumori overexpressed testicolo specifici geni che vengono espressi normalmente solo nelle cellule meiotic. Molti, anche se non tutte, delle differenze tra HNC HPV(+) e HPV(-) HNC hallmark erano una diretta conseguenza di HPV e in particolare il virali E6 ed E7 oncogeni. Questo includeva una romanzo associazione degli oncogeni HPV con l'espressione di gene specifico del testicolo. Questi risultati in tumori umani primari forniscono nuovi biomarcatori per la diagnosi precoce dei tumori HPV(+) e HPV(-) e sottolineano il valore potenziale di targeting funzione E6 ed E7, da sola o combinata con radiazioni e/o chemioterapia tradizionale, nel trattamento dei tumori HPV(+).
Uno Studio Delle Relazioni Tra Le Proprietà Del Oligonucleotide E Intensità Del Segnale Di Ibridazione Da NimbleGen Microarray DataSet
Ben definite relazioni tra le proprietà del oligonucleotide e ibridazione segnalano di intensità (HSI) può aiutare la progettazione dei chip, normalizzazione dati e conoscenza biologica vera scoperta. Chiarire questi rapporti utilizzando i dati da due esperimenti di microarray contenente oltre 3 milioni di sonde da 48 chip ad alta densità. Troviamo che temperatura di fusione (T(m)) ha l'effetto più significativo su HSI mentre lunghezza per i oligonucleotides lunghi studiato ha un effetto molto limitato. Analisi dell'effetto posizionale utilizzando un modello lineare forniscono la prova che le estremità sporgenti delle sonde contribuiscano più che finisce legati a HSI, che viene ulteriormente convalidato da specificamente progettato abbinare frammento scorrevole ed esperimenti di estensione. L'impatto della somiglianza di sequenza (SeqS) su HSI non è significativa rispetto ad altre proprietà del oligonucleotide. Utilizzando la regressione e l'analisi di regressione ad albero, assegnare priorità queste proprietà del oligonucleotide basate sui loro effetti su HSI. Vengono discusse le implicazioni delle nostre scoperte per la progettazione dei oligonucleotides imparziale. Proponiamo che sonde isotermiche progettate variando la lunghezza è una valida strategia per ridurre il bias di sequenza, anche se imporre vincoli di selezione su altre proprietà del oligonucleotide è anche essenziale.
MicroRNA 29C è Down-regolato in Carcinomi Nasofaringei, Up-regolazione MRNA Codificano Per Proteine Della Matrice Extracellulare
Utilizzando procedure basate su microarray altamente sensibili, abbiamo individuato otto microRNA (miRNAs) mostrando robusta espressione differenziale tra 31 cattura-laser-microdissected Carcinoma nasofaringeo (NPC) e 10 sani rinofaringei epiteliali campioni normali. In particolare, miRNA mir-29 c è stata espressa a un quinto livello in tumori come nel normale epitelio. Nei tumori NPC, i più bassi livelli di mir-29 c correlata con livelli più elevati di mRNA multipli cui UTRs 3' possibile associare mir-29 c a bersaglio sequenze conservate in molti vertebrati. In cellule in coltura, introduzione di mir-29 c giù-regolato questi geni a livello di mRNA e inibito espressione della luciferasi codificato da vettori avendo 3' UTRs di questi geni. Inoltre, per ciascuno dei diversi geni testati, mutando la destinazione c mir-29 siti nel 3' UTR abrogata mir-29 c-indotta di inibizione dell'espressione della luciferasi. La maggior parte dei mir-29 c-mirati geni identificati codificano proteine di matrice extracellulare, compreso più collageni e laminina gamma1, che sono associate con invasività delle cellule tumorali e caratteristiche prominenti, potenziale metastatiche di NPC. Così, noi identificare otto miRNAs differenzialmente espressi in NPC e dimostrare il coinvolgimento di uno nella regolazione dei geni coinvolti nella metastasi.
I MicroRNA Del Virus Epstein - Barr è Espresse a Livelli Notevolmente Differenti Tra Le Linee Di Cellule
Virus di Epstein - Barr (EBV) codifica più microRNA (miRNAs) da due trascrizioni primarie, BHRF1 e il BARTs. L'espressione di miRNAs BHRF1 è dipendente dal tipo di latenza virale, considerando che i miRNAs BART sono espressi nelle cellule durante tutte le forme di latenza. Non è noto come questi miRNAs sono diversamente regolati, però. Abbiamo usato quantitativa, gambo-ciclo, PCR in tempo reale per misurare l'espressione di miRNAs di EBV e li ha trovati a differire quasi 50 - e 25 volte tra tutte le linee cellulari testate e tra i linfomi di Burkitt EBV-positivi, rispettivamente. Inoltre, l'espressione dei singoli BART miRNAs all'interno di una cella può differire da 50 volte o più, nonostante il fatto che questi miRNAs sono probabilmente trascritto insieme come una singola trascrizione primaria. Queste misurazioni sono illuminanti: essi indicano che alcuni dei miRNAs di EBV sono espressi a livelli paragonabili a quelle dei cellulari miRNAs nella maggior parte delle linee cellulari e quindi probabile funzione interdipendente.
MicroRNA 92b Controlla Il P57 G1/S Checkpoint Genica in Cellule Staminali Embrionali Umane
Le cellule staminali embrionali umane (ES) esibiscono una fase del ciclo cellulare g (1) più breve rispetto la maggior parte delle cellule somatiche. Qui, si esamina il ruolo di un abbondante, umano ES arricchito cella microRNA, miR-92b, nella distribuzione del ciclo cellulare. Inibizione di miR-92b in human ES cells risultati in un numero maggiore di cellule nella fase g (1) e un numero inferiore in fase S. Al contrario, sovraespressione di miR-92b in cellule differenziate provoca una riduzione del numero di cellule in fase G1 e un aumento del numero nella fase S. P57, un gene il cui prodotto inibisce g (1) alla progressione di fase S, è uno degli obiettivi previsti di miR-92b. Inibizione di miR-92b in cellule ES umane aumenta i livelli di proteina p57 e miR-92b sovraespressione in cellule differenziate diminuisce i livelli di proteina p57. Inoltre, miR-92b inibisce un costrutto di reporter luciferasi che comprende parte della regione 3' non tradotta del gene p57 contenente la destinazione prevista della sequenza miR-92b seme. Così, ci mostrano che il miRNA miR-92b sottoregola direttamente livelli di proteina del G (1) /S checkpoint gene p57. CELLULE STAMINALI 2009; 27:1524-1528.
Uso Statistico Di Argonaute Espressione E Assembly RISC Nell'identificazione Di Target Di MicroRNA
MicroRNA (miRNAs) regola posttranscriptionally mirati RNA messaggero (mRNA) da indurre il clivaggio o altrimenti reprimere la loro traduzione. Affrontiamo il problema di individuare relazioni in homo sapiens da dati di microarray di targeting attraverso lo sviluppo di modelli statistici che sono motivati dai meccanismi biologici utilizzati da miRNAs m/miRNA. Il focus del nostro modeling è la costruzione, l'attività e la mediazione di RNA-induced silenziamento complessi (Chì) competente per la scissione di mRNA bersaglio. Dimostriamo che regressione modelli accomodante abbondanza RISC e controllo di altri fattori di mediazione montare i profili di espressione di coppie di destinazione noto sostanzialmente migliore rispetto ai modelli basati su espressioni m/miRNA da solo e portare a verifiche delle previsioni di coppia destinazione computazionale che sono più sensibili rispetto a quelli basati su livelli di espressione marginale. Perché i nostri modelli sono completamente indipendenti dei risultati esogeni da metodi computazionali basate sulla sequenza, sono appropriati per l'utilizzo come una fonte primaria o secondaria di informazioni riguardanti m/miRNA target coppia relazioni, soprattutto in collaborazione con studi di espressione high-throughput.
Altamente Coerente, Pienamente Rappresentativo MRNA-Seq Librerie Da Dieci Nanogrammi Di RNA Totale
Preparazione di una libreria di sequenziamento Illumina per analisi di espressione genica (mRNA-Seq) richiede quantità microgrammi di partenza RNA totale o amplificazione di PCR-based. Qui descriviamo un protocollo basato sull'amplificazione lineare di RNA T7 che non introduce significative bias, richiede solo 10 ng RNA totale e genera una libreria dei Illumina direzionale, pienamente rappresentativo, intera-trascrizione mRNA-Seq che è altamente coerenza in tutto oltre tre ordini di grandezza di input RNA.
