La Clonación, Los Tejidos De Distribución, Y La Expresión Funcional De La Proteína Beta Humana Subunidad G-4

Physiological Genomics. Feb, 2002  |  Pubmed ID: 11842130

Heterotrimeric proteínas G (Galphabetagamma) desempeñan un papel esencial en el acoplamiento de los receptores de membrana de proteínas efectoras, tales como los canales iónicos y las enzimas. Entre los cinco mamíferos Gbeta subunidades clonadas, la proteína G humana beta4 no se ha descrito. El propósito del presente estudio fue caracterizar funcionalmente humana recién identificada Gbeta4 subunidad. El bastidor Gbeta4 lectura abierta (ORF) se amplificó utilizando PCR a partir de cerebro de cDNA. Cebadores de amplificación se genera después de 5 'rápida amplificación de cDNA extremos (5'-RACE) de una etiqueta de secuencia expresada (EST) que contiene el predicho extremo 3' de la proteína. Múltiples análisis de tejido de ADNc del panel mostró que Gbeta4 ARNm se expresa con fuerza en el pulmón y la placenta, mientras que es débilmente expresados ​​en el cerebro y el corazón. Sobreexpresión heteróloga de Gbeta4gamma2 o Gbeta4gamma4 en neuronas de rata resultó simpático en la modulación tónica de tipo N voltaje de Ca (2 +) y la proteína G-cerrada por dentro rectificación de K (+) corrientes. Además, la coexpresión de Gbeta4gamma2 y Galpha (OA) dio lugar a la formación de heterotrímero. Estos resultados muestran que el recién clonado subunidades Gbeta acciones varias propiedades con otros miembros de la familia humana Gbeta.

La Desensibilización Del Grupo I, Receptores De Glutamato Metabotrópicos En Ratas Las Neuronas Simpáticas

Journal of Neurophysiology. Apr, 2002  |  Pubmed ID: 11929888

La desensibilización de los heterologously expresó 5a metabotrópicos receptores de glutamato (mGluR5a) se examinó en ratas las neuronas simpáticas. Corrientes de calcio en las células que expresan mGluR5a exhibieron una inhibición sustancial en respuesta a glutamato exposición. En la presencia continua de glutamato, la inhibición atenuada rápidamente durante el curso de aproximadamente un minuto. La desensibilización fue eliminado cuando un análogo no hidrolizable de ATP se sustituyó por ATP en la solución de la pipeta, lo que sugiere que la desensibilización estaba mediada por un evento de fosforilación. A continuación, los agentes farmacológicos se utilizaron para investigar la naturaleza de la quinasa participa en la desensibilización. La desensibilización fue sensible a la inhibidor de la quinasa específica, estaurosporina, pero no H-7, otro inhibidor de la cinasa específica. Los inhibidores de la quinasa de cadena ligera de miosina y la quinasa dependiente de calmodulina no tenían ningún efecto sobre la desensibilización. Sin embargo, la desensibilización fue sensible a la proteína quinasa bisindolymaleimide inhibidor de la C. En contraste, Gö6976, un inhibidor selectivo de la proteína quinasa convencionales isoformas C, no tuvo efecto. Además, la desensibilización persistió en la presencia de 10 mM intracelular bis-(o-aminofenoxi)-N, N, N ', N'-tetraacético, un rápido Ca (2 +) quelante. Finalmente, la sobreexpresión de tipo salvaje calmodulina, que puede unirse e inhibir la fosforilación de mGluR5, no alteró la desensibilización mGluR. Dos de Ca (2 +)-unión de mutantes deficientes en calmodulina eran también sin efecto. Estos datos indican un papel para no convencionales de la proteína cinasa C isoformas como un mediador de la desensibilización y el mGluR5 que la fosforilación de mGluR5a que compite con la unión a calmodulina no mediar la desensibilización.

Importancia Del ácido Gamma-aminobutírico (B) Del Receptor C-terminal De Anclaje De La Proteína G

Molecular Pharmacology. May, 2002  |  Pubmed ID: 11961124

Funcional ácido gamma-aminobutírico (B) (GABA (B)) receptores de montaje a partir de dos subunidades, el GABA (B (1)) y el GABA (B (2)). Este heteromerización, que consiste en un C-terminal en espiral de la bobina de la interacción, garantiza el tráfico de superficie eficiente y agonista dependiente de la activación de la proteína G. En el presente estudio, tomamos una mirada más atenta a las implicaciones de las terminales C intracelulares de GABA (B (1)) y GABA (B (2)) para el acoplamiento de la proteína G. Hemos generado una serie de C-terminal de mutantes de GABA (B (1)) y GABA (B (2)), y los puso a prueba para la interacción física, el tráfico de superficie, el acoplamiento a la adenilil ciclasa, y la proteína G-cerrada por dentro rectificación de los canales de potasio en el riñón embrionario humano (HEK) 293 células, así como en los canales de calcio endógenas en las neuronas simpáticas del ganglio cervical superior (SCG). Hemos encontrado que la interacción C-terminal contribuye sólo parcialmente al conjunto heterodimérica de las subunidades, indicando la presencia de un sitio de interacción adicional. La señal se describe endoplásmico retención retículo en el terminal C del GABA (B (1)) funcionó sólo en el contexto de aminoácidos específicos, que constituyen parte del GABA (B (1)) espiral de la bobina secuencia. Este hallazgo puede proporcionar un vínculo entre la señal de la retención y su protección por la espiral de la bobina de GABA (B (2).) En las células HEK293, se observó que los dos bien conocidos GABA (B) antagonistas de los receptores [S-(R * , R *)] - [3 - [[1 - (3,4-diclorofenil) etil] amino]-2-hidroxipropil] (ciclohexilmetil) fosfínico (CGP54626) y (+) - (2S) -5,5 - dimetil-2-morpholineacetic ácido (SCH50911) CGP54626 y SCH50911 funcionar como agonistas inversos. El termini C de GABA (B (1)) y el GABA (B (2)) fuertemente influenciada agonista-independiente de la proteína G de acoplamiento, aunque no eran necesarios para agonista dependiente de la proteína G de acoplamiento. Los C-terminal de GABA (B) de los receptores mutantes descritos aquí demuestran que la conformación del receptor activo se estabiliza por la interacción espiral de la bobina. Así, la conformación C-terminal de la GABA (B) del receptor puede determinar su actividad constitutiva, que podría ser una diana terapéutica para agonistas inversos.

Mensajero M Misterio Revelado Actual?

Neuron. Aug, 2002  |  Pubmed ID: 12165463

La identidad de los elementos de señalización que se acoplan los receptores muscarínicos de acetilcolina (mAChR) la activación de M actual (KCNQ K (+) canales) de modulación ha permanecido desconocido a pesar de décadas de estudio. Suh y Hille (en este número de neuronas) demuestran que la activación de la fosfolipasa C (PLC) inicia la modulación M actual y que la recuperación requiere ATP y fosfoinosítidos 4-quinasa (PI 4-K). Estos datos sugieren que la ruptura de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP (2)) es un determinante crucial de la M canal de modulación.

Metabotrópicos De Glutamato La Expresión Del Receptor En El Ganglio Cervical Superior De Rata

Neuroscience Letters. Sep, 2002  |  Pubmed ID: 12270642

Para comenzar a determinar cuáles son los receptores metabotrópicos de glutamato (papel mGluRs) juegan en el sistema nervioso periférico, la transcriptasa inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) se utilizó para la sonda de ARN aislado de las neuronas simpáticas del ganglio cervical superior de rata (SCG). RT-PCR se diseñaron los cebadores para la detección de cada una de las ocho transcripciones mGluR rata. Sólo uno, mGluR7, se detectó en el ARN de SCG rata, aunque cada uno parecía estar presente en el ARN de cerebro de rata conjunto. Aunque mGluR7 ARN mensajero es aparentemente presente en SCG rata, funcional mGluR7 no se observó, como aplicación de glutamato ni tampoco el agonista del grupo III mGluR L-2-amino-4-phosphonobutyrate (L-AP4) producido calcio corriente de modulación en las neuronas aisladas SCG , como cabría esperar. Sin embargo, tras mGluR7 expresión heteróloga, la aplicación de L-AP4 produjo la modulación de calcio corriente moderada en las neuronas aisladas, lo que indica que mGluR7 puede expresar en la superficie de CGS soma, y ​​que su activación puede modular las corrientes de calcio.

Especificidad De Los Receptores Metabotrópicos De Glutamato 2 De Acoplamiento a Proteínas G

Molecular Pharmacology. Jan, 2003  |  Pubmed ID: 12488551

Receptores de glutamato metabotrópicos 2 (mGluR2) es una clase 3 acoplado a proteína G del receptor y un mediador importante de la actividad sináptica en el sistema nervioso central. Trabajos anteriores demostraron que mGluR2 parejas a la toxina pertussis (PTX) sensibles a las proteínas G. Sin embargo, la especificidad de mGluR2 acoplamiento a los miembros individuales de la G (E / S) de la familia no se conoce. Usando heterologously expresó mGluR2 en neuronas de rata simpáticas del ganglio cervical superior (SCG), el perfil de proteínas mGluR2 / G de acoplamiento se caracteriza por la reconstitución de acoplamiento en las células tratadas con PTX expresar PTX-mutante insensible a las proteínas y Galpha Gbetagamma. Empleando este método, se demostró que mGluR2 acoplado fuertemente con Galphaob, Galphai1, Galphai2, y Galphai3, aunque el acoplamiento a Galphaoa era menos eficaz. Además, mGluR2 no parecía acoplarse al miembro más divergente de la G (E / S) de la familia, Galphaz, aunque Galphaz fuertemente acoplada a la de los receptores adrenérgicos alfa 2 endógena. Para determinar qué proteínas Galpha puede ser nativa expresada en las neuronas SCG, la presencia de mRNA para diversas proteínas Galpha fue probada usando la transcripción reversa de la polimerasa reacción en cadena. Bandas se detectaron fuertes para todos los miembros de la G (E / S) de la familia (Galphao, Galphai1, Galphai2, Galphai3, Galphaz), así como para Galpha11 y Galphas. Una señal débil se detectó por Galphaq y no se detectó ARNm Galpha15.

Una Variante De Empalme De La Versión Beta De La Proteína G 3-subunidad Implicado En La Enfermedad De Los Estados No Modula Los Canales Iónicos

Physiological Genomics. Apr, 2003  |  Pubmed ID: 12595577

Un polimorfismo de nucleótido único (C825T) en el gen GNB3 produce una variante de empalme alternativo de la proteína G heterotrimeric subunidad beta3 (Gbeta3). La traducción de los resultados de mRNA empalmados alternativamente en un producto de proteína, Gbeta3-s, en el que 41 aminoácidos se eliminan de Gbeta3. Interesantemente, los estudios anteriores indican que el alelo C825T se produce con una alta frecuencia en pacientes con ciertos trastornos vasculares. Sin embargo, hay poca información disponible sobre el papel funcional Gbeta3-s podría jugar en la modulación de canales de iones. Para examinar este aspecto, Gbeta3 o Gbeta3-s, junto con cualquiera Ggamma2 o Ggamma5, se expresaron en las neuronas simpáticas de rata por microinyección nuclear de vector que codifica la proteína deseada. En contraste con Gbeta3, la expresión de Gbeta3-s no modular de tipo N de Ca (2 +) o la proteína G-cerrada interiormente rectificar K (+) canales. Además, Gbeta3-s No parece que complejo con una toxina pertussis insensible mutante de Galpha (I2) o una pareja de forma nativa expresada alfa (2)-adrenérgicos. Por último, la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) las mediciones indicaron que el aumento de la proteína amarilla fluorescente (EYFP)-etiquetados Gbeta3-s no se forma un heterodímero Gbetagamma cuando coexpressed con aumento de la proteína fluorescente cian (ECFP)-etiquetados Ggamma2. Por lo tanto, cuando se expresan en las neuronas simpáticas, Gbeta3-s parece carecer de actividad biológica - por lo tanto, presentan patologías en los pacientes portadores del alelo C825T homocigota puede ser consecuencia de un golpe de gracia funcional de Gbeta3.

Los Endocannabinoides Modulan La N-tipo De Canales De Calcio Y La Proteína G-acoplada Interiormente Rectificación De Los Canales De Potasio Vía Heteróloga De Receptores Cannabinoides CB1 Expresados ​​en Neuronas De Mamíferos

Molecular Pharmacology. Mar, 2004  |  Pubmed ID: 14978245

Los endocannabinoides pueden servir como mensajeros retrógrados para inhibir la liberación de neurotransmisores durante la despolarización inducida por la supresión de la inhibición (DSI) o de excitación (DSE). Por lo tanto, si la prueba endocannabinoides inhiben tipo N dependientes de voltaje canales de Ca2 + mediante la activación de G (E / S)-proteína unida receptores cannabinoides CB1 (CB1R), un posible mecanismo subyacente JMS / DSE. Tres supuestos endocannabinoides [2-araquidonilglicerol (2-AG), 2-araquidonil éter de glicerol (2-AGE), y la anandamida (AEA)] y el aminoalkylindole cannabimimético WIN 55,212-2 (WIN) inhibió de células enteras corrientes de Ca2 + en la rata simpática neuronas previamente inyectados con ADNc que codifica una CB1R humana. Agonista mediada por Ca2 + inhibición de corriente fue bloqueado por un antagonista selectivo CB1R [SR141716A, N-(piperidin-1-il) -5 - (4-clorofenil) -1 - (2,4-diclorofenil)-4-metil-1H- pirazol-3-carboximide] hidrocloruro y la toxina pertussis (PTX) pretratamiento. El orden de potencia era ganar (IC50 = 2 nM)> 2-EDAD (350 Nm) de aproximadamente el 2-AG (480 nm)> AEA (aproximadamente 3 microM), con cada agonista mostrando una eficacia similar (aproximadamente el 50% de inhibición máxima) . Un aumento en la expresión CB1R mejorado significativamente la potencia de AEA. AEA (10 microM) también inhibe la Ca2 + canales en un voltaje-independiente, CB1R independiente, y la forma PTX-sensible, mientras que el 2-AG y 2 EDAD-carecían de esta actividad. Los tres endocannabinoides activan la proteína G-acoplada por dentro rectificar potasio (GIRK) canales, GIRK1 / 4, heteróloga expresadas en las neuronas simpáticas. Estos resultados sugieren un mecanismo por el cual endocannibinoids podría influir en la función presináptica.

La Expresión De La Proteína G Componentes De Señalización En Las Neuronas De Mamíferos Adultos Mediante Microinyección

Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 2004  |  Pubmed ID: 15250492

Aunque los métodos para expresar proteínas extrañas en líneas celulares clonales están bien establecidos, las neuronas maduras siendo una preparación difícil para la introducción de genes extraños. La microinyección es un método fiable para la producción de robusta expresión específica en las neuronas que tiene ventajas sobre los convencionales de transfección / infección metodologías. Aquí, se describen los procedimientos para la expresión de proteínas de señalización en las neuronas simpáticas de rata adulta mediante microinyección directa de cRNA y cDNA en el citoplasma y núcleo, respectivamente. Los métodos son aplicables a una amplia variedad de preparaciones de neuronas periféricas y centrales, así como líneas clonales de células.

El Uso De RGS-insensibles Subunidades Galpha Para El Estudio De La Acción Endógena De Proteínas RGS En La Modulación De La Proteína G De Canales De Calcio Tipo N, En Las Neuronas Simpáticas

Methods in Enzymology. 2004  |  Pubmed ID: 15313566

Los reguladores de señalización de proteínas G (RGS) las proteínas son una gran familia de proteínas de señalización que controlan tanto la magnitud y las características temporales de la heterotrimeric G-proteína de señalización mediada. Un desafío actual es definir la forma en la función endógena de la proteína RGS impacto de la proteína G de modulación de los canales iónicos en las neuronas de mamíferos. La estrategia experimental se describe aquí utiliza diferentes mutaciones en subunidades Galpha que le confieren la toxina de Bordetella pertussis (PTX) y la insensibilidad RGS proteínas. La vía nativo de señalización en las neuronas simpáticas de rata que media dependiente de la tensión de modulación de tipo N Ca2 + canales se realiza la ablación por tratamiento PTX y la señalización se reconstituye expresando una PTX / RGS-insensible mutante Galpha junto con subunidades Gbeta y Ggamma. Como las neuronas son resistentes a las modalidades de transfección convencionales, la expresión heteróloga se logra mediante la microinyección directa de los plásmidos en el núcleo de la neurona. Una ventaja de este enfoque es que el conocimiento de los subtipos RGS específicas que participan en la vía no es necesario. Desde las consiguientes alteraciones en la cinética y la farmacología de la modulación del receptor de la proteína G de acoplamiento de tipo N, canales de Ca2 +, podemos inferir las funciones RGS proteínas endógenas jugar en la vía de señalización.

Las Modalidades Alternativas De Adenovirus Mediada Por La Expresión Génica En Neuronas Cultivadas De Hipocampo En El Sustrato Microisland

Neuroscience Letters. Sep, 2004  |  Pubmed ID: 15351453

Anteriormente, hemos utilizado CsCl gradiente de adenovirus recombinante purificada (ADV) para transferir con éxito genes en las neuronas del hipocampo cultivadas en sustrato microisland. Aquí, se reporta que la purificación de las partículas de ADV no es necesaria y la expresión génica eficaz se puede lograr utilizando crudo lisados ​​AdV o HEK 293 células infectadas con Adv. Las ventajas del procedimiento simplificado, se reducen enormemente el tiempo de preparación y reducción de las necesidades de equipo y la experiencia.

La Modulación De Los Canales Iónicos Y La Transmisión Sináptica Por Un Ser Humano Sensorial Neuronal Específica Del G-receptor Acoplado a Proteína, SNSR4/mrgX1, Heterologously Expresó En Neuronas De Rata Cultivadas

The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. May, 2004  |  Pubmed ID: 15163697

Humanos sensoriales específicos de neuronas-G-receptores acoplados a proteínas (SNSRs) se expresa solamente en las neuronas sensoriales de pequeño diámetro primaria. Este patrón de expresión restringido es de interés terapéutico considerable, porque los nociceptores pequeños transmitir mensajes de dolor crónico. La función neuronal de SNSRs humanos es difícil de evaluar debido a los roedores orthologs aún no se han definido claramente, y las isoformas individuales se encuentran sólo en un pequeño subconjunto de neuronas sensoriales primarias. Para evitar este problema, hemos expresado humana SNSR4 (hSNSR4, también conocida como Hs.mrgX1) en la rata del ganglio cervical superior (SCG), ganglio de la raíz dorsal (GRD), y las neuronas del hipocampo mediante inyección nuclear o adenovirus recombinantes y examinó la modulación de los canales iónicos y la neurotransmisión utilizando células enteras patch-clamp técnicas. BAM8-22 (un 15 aminoácido C-terminal del fragmento de péptido bovina médula suprarrenal 22), un agonista péptido derivado de proencefalina, inhibió alto (pero no bajo) voltaje activado por corriente de Ca2 + en tanto DRG y SCG neuronas que expresan hSNSR4, mientras que no se respuesta fue detectado en las neuronas de control. La inhibición de la corriente de Ca2 + es dependiente de la concentración y la parte sensible a la toxina pertussis (PTX) de tratamiento. Además, el péptido fue altamente efectiva en la modulación de corrientes derivados de la M-tipo de canales de K + en las neuronas que expresan hSNSR4 SCG. En las neuronas del hipocampo expresan hSNSR4, la inhibición presináptica BAM8-22 inducida por la transmisión que fue abolida después del tratamiento con PTX. Nuestros datos indican que hSNSR4, cuando heteróloga expresada en neuronas de rata, puede ser activado por un péptido opioide relacionada, pareja a G (q/11)-proteínas, así como PTX sensibles G (I / O) de proteínas, y modula neuronales canales de Ca2 +, los canales de K +, y la transmisión sináptica.

El Acoplamiento De Los Receptores De Glutamato Metabotrópicos 8 a La N-tipo De Canales De Ca2 + En Las Neuronas Simpáticas De Rata

Molecular Pharmacology. Jun, 2005  |  Pubmed ID: 15755905

Grupo III receptores metabotrópicos de glutamato (mGluRs; mGluR4, 6, 7 y 8) a la par Galpha (E / S)-que contiene heterotrímeros a proteínas G y actúan como autorreceptores para regular la liberación de glutamato, probablemente mediante la inhibición de voltaje de Ca (2 + ) canales. Aunque la mayoría de mGluRs han expresado funcionalmente en una variedad de sistemas, pocos estudios han demostrado acoplamiento robusto de receptores mGlu8 a los efectores. Por lo tanto, si la prueba de activación de receptores mGlu8 inhibido Ca (2 +) canales. Tanto la L-glutamato (L-Glu) y L-2-amino-4-phosphonobutyric ácido (L-AP4), un agonista selectivo para el grupo III mGluRs, inhibido de tipo N de Ca (2 +) en corriente de rata superiores neuronas del ganglio cervical previamente inyectados con un ADNc que codifica mGluR8a / b. L-AP4 fue de aproximadamente 100 veces más potente (IC (50) = 0,1 microM) que la L-Glu (aproximadamente 10 microM), pero tenía una eficacia similar a la de la L-Glu (aproximadamente 50% de inhibición máxima). La potencia y la eficacia de la L-AP4 y L-Glu fueron similares para ambas variantes de empalme. Agonista inducida por la inhibición fue suprimido por el pretratamiento con (R, S)-alfa-ciclopropil-4-phosphonophenylglycine, un grupo selectivo III antagonista mGluR, y toxina de pertussis. La eliminación de cualquiera de una calmodulina (CaM) motivo de unión en el extremo C o toda la terminal C de mGlu8 no afectó la respuesta mediada por receptores mGlu8. Nuestros estudios indican que tanto mGluR8a y 8b son capaces de inhibir tipo N de Ca (2 +) del canal, lo que sugiere un papel como autorreceptores presinápticos para regular la excitabilidad neuronal. Los estudios también implica que el potencial de dominio CaM unión no es necesaria para el Ca receptores mGlu8 mediada (2 +) la inhibición del canal y el terminal C de mGluR8a es prescindible para el receptor de acoplamiento a la N-tipo Ca (2 +) canales.

Expresión De REM2, Una GTPasa Pequeña Familia RGK, Reduce Calcio Tipo N Actual Sin Afectar La Densidad De Canales De Superficie

The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. Oct, 2005  |  Pubmed ID: 16237180

Rad, Gema / Kir, Rem, y REM2 son miembros de la RGK Ras relacionados (Rad, Gema, y ​​Kir) la familia de pequeñas proteínas de unión a GTP. Expresión heteróloga de proteínas RGK interfiere con el tráfico de canal de calcio novo montaje / y disminuye drásticamente la amplitud de las corrientes derivadas de preexistente de alto voltaje-activados los canales de calcio. Estos efectos son probablemente el resultado de la interacción directa de las proteínas RGK con subunidades beta del canal de calcio. Entre la familia RGK, REM2 es el único miembro expresa abundantemente en los tejidos neuronales. En este sentido, se analizó la capacidad de modular la REM2 endógenos activados por voltaje de los canales de calcio en ratas las neuronas del ganglio simpático y la raíz dorsal. Expresión heteróloga de REM2 las corrientes de calcio casi abolido derivados de la ya existente de alta tensión activados por los canales de calcio, sin afectar de bajo voltaje-activados por los canales de calcio. REM2 la inhibición de los canales de calcio tipo N, requiere tanto de la homología de Ras (núcleo) de dominio y la terminal C polibásico. La mutación de un GTP/Mg2 putativo + motivo de unión en REM2 no afectó la supresión de las corrientes de calcio. Carga de las neuronas con un PIB-beta-S a través de la pipeta parche no invertir REM2 mediada por la inhibición del canal de calcio. Por último, [(125) I] Tyr22-omega-conotoxina superficie GVIA une a las células en células que expresan establemente tsA201 tipo N, los canales de calcio no fue alterada por REM2 expresión en un momento en que la corriente de calcio fue abolida por completo. Juntos, nuestros resultados apoyan un modelo en el que REM2 localiza en la membrana plasmática a través de un motivo C-terminal de polibásico e interactúa con las subunidades beta de calcio de los canales en el premontado N-tipo de canal, formando así una especie no conductores.

Atenuar Phosducin Y Phosducin-al Igual Que La Proteína G-receptor Acoplado a Proteína Mediada Por La Inhibición De Los Canales De Calcio Dependientes Del Voltaje En Las Neuronas Simpáticas De Rata

Molecular Pharmacology. Jul, 2006  |  Pubmed ID: 16608918

Phosducin (PDC) se ha demostrado en experimentos estructurales y bioquímicos de obligar a la subunidad Gbetagamma de heterotrimeric G-proteínas. Una función de propuesta de la proteína PDC y phosducin como-(PdCl) es el secuestro de "libre" Gbetagamma de la membrana plasmática, poniendo así fin a la señalización de Gbetagamma. El impacto funcional de heterologously expresó PDC y PdCl en el canal de calcio tipo N (Cav2.2) de modulación se examinó en las neuronas simpáticas, aislado de la rata de cuello uterino ganglios superior, utilizando células enteras fijación de voltaje. Expresión de PDC y PdCl atenuada tensión dependiente de la inhibición de los canales de calcio del tipo N, un proceso Gbetagamma-dependiente, de una manera dependiente del tiempo. El calcio de inhibición de corriente después de una breve exposición a la norepinefrina se alteró mínimamente por el PDC o expresión PdCl. Sin embargo, en la presencia continua de la norepinefrina, PDC o PdCl inhibición aliviado los canales de calcio en comparación con las neuronas de control. Hemos observado resultados similares después de la activación de la heteróloga expresadas receptores metabotrópicos de glutamato con 100 microM L-glutamato. Las neuronas que expresan PDC o PdCl mantiene la supresión de la inhibición después de la re-exposición al agonista. A diferencia de otras proteínas que suprimen el secuestro de Gbetagamma la inhibición a corto plazo de canales de Ca2 +, PDC y PdCl requieren la exposición prolongada agonista antes de los efectos sobre la modulación se realizan.

Photobleaching YFP No Produce Una Especie PPC-como La Que Afecta a Las Mediciones De FRET

Nature Methods. Jul, 2006  |  Pubmed ID: 16791204

La Medición De FRET Eficiencia Y La Relación De Los Donantes a La Concentración De Aceptor En Las Células Vivas

Biophysical Journal. Sep, 2006  |  Pubmed ID: 16815904

Medición de la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) la eficiencia y la concentración relativa de fluoróforos donante y aceptor en las células vivas, utilizando el enfoque cubo de tres filtro requiere la determinación de dos constantes: 1), la proporción de emisión aceptor sensibilizado a temple donante de fluorescencia ( factor G) y 2), la relación de intensidad donante / aceptor de fluorescencia para concentraciones equimolares en la ausencia de FRET (factor K). Hemos desarrollado un método para determinar G y K, que utiliza dos dador-aceptor proteínas de fusión con diferentes eficiencias FRET-el valor de que no necesita ser conocida. Hemos validado el método midiendo la relación FRET eficiencia y la concentración del fluorescente Cerúlea proteínas y Venus en células de mamíferos que expresan una serie de proteínas de fusión con estequiometrías variables. El método simplifica en gran medida cuantitativa FRET medición en las células vivas, ya que no requiere la fijación de células, fotoblanqueo aceptor, purificación de proteínas, o equipo especializado para determinar espectros de fluorescencia o de por vida.

Fluoróforo Asistido Por La Inactivación De Luz Produce Tanto Efectos Selectivos Y La Garantía De La Modulación De Tipo N De Canales De Calcio En Neuronas De Rata Simpáticos

The Journal of Physiology. Oct, 2006  |  Pubmed ID: 16873413

Fluoróforo asistido por la inactivación de la luz (FALI) es un método para inactivar proteínas específicas en una escala de tiempo de segundos a minutos usando ya sea la luz difusa o coherente. Aquí examinamos una nueva modalidad FALI que utiliza un polipéptido conjugado con fluoresceína, alfa-bungarotoxina (BTX) y un 13 aminoácidos BTX-sitio de unión diseñado en el extremo N-terminal de receptores de glutamato metabotrópicos 8a (mGluR8a), una clase C G- receptor acoplado a proteína (GPCR). El mGluR8a etiquetado se expresó en ratas las neuronas simpáticas y marcado con fluoresceína conjugado de toxina botulínica (BTX-FL). La eficacia de FALI se evaluó mediante el control de mGluR8a mediada por la inhibición de las corrientes de calcio (I (Ca)) utilizando células enteras fijación de tensión-técnicas. A consecuencia de la iluminación de campo amplio o un láser de FL-BTX-etiquetados neuronas, mGluR8a mediada I (Ca), la inhibición fue muy atenuada, mientras que la celebración actual y básica I (Ca), las medidas de los efectos no específicos, se vieron mínimamente afectados. La azida sódica, un extintor colisión de oxígeno singlete, reduce la magnitud de los efectos mediados por FALI apoyan un papel para las especies de oxígeno reactivo en el proceso. Aunque estos resultados fueron consistentes con una inactivación aguda de mGluR8a, el objetivo previsto, dos hallazgos confundido esta interpretación. En primer lugar, los efectos en una vía de señalización de forma nativa expresada, alfa (2)-adrenérgicos mediada por los receptores I (Ca), la modulación, se observaron después de la iluminación de las neuronas que expresan FL-BTX-etiquetados de sodio subunidades beta 2 canales ionotrópicos o 5-HT (3), los receptores , las proteínas con una relación abierta a las vías de señalización de GPCR. En segundo lugar, GPCR independiente que (Ca) de modulación inducida con imidophosphate guanilil intracelular también fue atenuada por el FALI. Estos datos desafían la suposición de que la proteína marcada con fluoróforo es el único objetivo de FALI y proporcionar la prueba que los daños colaterales a las proteínas proximal se produce después de la iluminación fluoróforo.

Canales De Calcio Diversificar Su Cartera De Señalización

Nature Neuroscience. Mar, 2007  |  Pubmed ID: 17318216

Estimación De La Proteína-proteína Interacción De Afinidad En Las Células Vivas Utilizando Cuantitativos Förster Resonance Energy Transfer Mediciones

Journal of Biomedical Optics. Sep-Oct, 2007  |  Pubmed ID: 17994899

Hemos demostrado anteriormente que Forster transferencia de energía de resonancia (FRET) la eficiencia y la relativa concentración de fluoróforos donante y aceptor puede ser determinada en las células vivas con tres cubos de campo amplio y microscopía de fluorescencia. En este sentido, ampliar la metodología para estimar el equilibrio de disociación efectiva constante (Kd) y el valor intrínseco FRET eficiencia (Emax) de una interacción donante-receptor par. Suponiendo interacción bimolecular, el predicho FRET eficiencia es una función de la concentración de los donantes, la concentración de aceptor, Kd, ​​y Emax. Estimamos Kd y Emax minimizando la suma del error cuadrado (SSE) entre el predicho y medido FRET eficiencia. Esto se logra mediante el examen de la topología de los valores SSE para una matriz de hipotéticos valores de Kd y Emax. La aplicación de un test F, el contorno de confianza del 95% de Kd y Emax se calcula. Probamos el método por el que expresa una inducible FRET par de fusión que consta de FKBP12-Cerúlea y FRB-Venus en las células HeLa. A medida que la Kd para FKBP12-rapamicina y FrB ha sido determinada analíticamente, la relación Kd (en unidades de fluorescencia) puede ser calibrado con un valor basado en la concentración de proteínas. La metodología descrita debe ser útil para comparar la proteína-proteína afinidades de interacción en las células vivas.

N-araquidonoil L-serina, Un Endocannabinoide Putativo, Altera La Activación De N-tipo De Canales De Ca2 + En Las Neuronas Simpáticas

Journal of Neurophysiology. Aug, 2008  |  Pubmed ID: 18234973

El efecto de la N-araquidonoil L-serina (ARA-S), un recientemente descubierto ácido lipoamino encuentra en el SNC, el tipo N Ca2 + canales de neuronas de rata ganglio simpático se determinó utilizando la abrazadera conjunto parche celular. Aplicación de ARA-S producido un aumento rápido y reversible de la corriente de Ca2 + que era dependiente de la tensión y el resultado de un cambio hiperpolarización en la curva de la activación. ARA-S no influye en la modulación de la proteína G del Ca2 + y los canales que parecía actuar de forma independiente de los receptores acoplados a proteína G-. Estos resultados proporcionan una base para la investigación de las posibles funciones de ARA-S en función del sistema nervioso.

Una Mutación Puntual Que Galphai Bloquea Selectivamente Motif GoLoco Encuadernación: Evidencia Directa De Complejos Galpha.GoLoco En Dinámica Del Huso Mitótico

The Journal of Biological Chemistry. Dec, 2008  |  Pubmed ID: 18984596

Heterotrimeric proteína G subunidades Galpha y proteínas GoLoco motivo son miembros clave de un conjunto conservado de proteínas reguladoras que influyen en la división celular asimétrica de invertebrados y vertebrados neuroepitelio y la diferenciación de células progenitoras epiteliales. Proteínas GoLoco motivo unirse selectivamente a la subclase inhibitoria (Galphai) de subunidades Galpha, y por tanto se supone que un motivo Galphai.GoLoco complejo proteína juega un papel directo en la dinámica de microtúbulos funcional subyacentes orientación del husillo y la segregación cromosómica metafase durante la división celular. Para hacer frente a esta hipótesis directamente, racionalmente identificado una mutación puntual para subunidades Galphai que representa una pérdida selectiva de la función para la unión motivo GoLoco, a saber, una sustitución de la asparagina-a-isoleucina en el bucle alphaD-alphaE del dominio Galpha helicoidal. Este GoLoco de insensibilidad ("Gli") mutación impide Galphai1 asociación con todas las proteínas con motivos humanos GoLoco y la interacción entre la subunidad derogó Caenorhabditis elegans Galpha GOA-1 y la GPR-1 GoLoco motivo. En contraste, la mutación GLi no perturbar otras propiedades bioquímicas o señalización de subunidades Galphai, incluyendo unión de nucleótidos, intrínseca y RGS proteína acelerado por hidrólisis de GTP, y las interacciones con Gbetagamma dímeros, adenilato ciclasa, y siete receptores de dominio transmembrana. Falta de sensibilidad GoLoco prestados subunidades Galphai incapaces de reclutar proteínas GoLoco motivos tales como GPSM2/LGN y GPSM3 a la membrana plasmática, y abrogó el huso mitótico exagerada mecedora normalmente se ve en la expresión ectópica de tipo salvaje subunidades Galphai en las células epiteliales renales. Esta mutación GLi debería ser de utilidad en el establecimiento de las funciones fisiológicas de los complejos de proteínas Galphai.GoLoco motivo en la dinámica de los microtúbulos y la función del eje durante la división celular, así como para delinear las posibles funciones de los motivos en GoLoco mediada por los receptores de transducción de señales.

La Inhibición De Los Canales De Calcio Tipo N, Por La Activación De GPR35, Un Receptor Huérfano, Heterologously Expresó En Ratas Las Neuronas Simpáticas

The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. Jan, 2008  |  Pubmed ID: 17940199

GPR35 es una proteína G-receptor acoplado recientemente "des-orphanized" usando mediciones de alto rendimiento de calcio intracelular en líneas celulares clonales que expresan un quimérico proteína G subunidad alfa. Desde estas pantallas, el ácido quinurénico, un metabolito endógeno de triptofano y Zaprinast, un inhibidor sintético de la guanosina monofosfato cíclico fosfodiesterasa específica, surgió como agonistas potenciales para GPR35. Para investigar el acoplamiento de GPR35 a nativa expresadas vías neuronales de señalización y los efectores, que heteróloga expresada GPR35 en las neuronas simpáticas de rata y se examinaron la modulación de tipo N (Ca (V) 2,2) canales de calcio. En las neuronas que expresan GPR35, los canales de calcio fueron inhibidas en ausencia de agonistas manifiestos, lo que indica una actividad del receptor tónico. Aplicación de ácido quinurénico o Zaprinast resultó en robusto dependiente de la tensión característica calcio inhibición actual de Gbetagamma mediada por la modulación. Ambos independientes agonista y efectos dependientes de GPR35 fueron bloqueados por el pretratamiento toxina de Bordetella pertussis que indica la participación de G (I / O) de proteínas. En las neuronas que expresan GPR35a, una variante de empalme corto de GPR35, Zaprinast era más potente (CE (50) = 1 microM) que el ácido quinurénico (58 microM), pero tuvo una eficacia similar (aproximadamente el 60% de inhibición máxima de la corriente de calcio). Expresión de GPR35b, que tiene un período adicional de 31 residuos en el término N, produjo resultados similares, pero con la variabilidad mucho mayor. Tanto GPR35a y GPR35b parecía tener similares patrones de expresión cuando se fusionó con proteínas fluorescentes. Estos resultados sugieren un posible papel de GPR35 en la regulación de la excitabilidad neuronal y la liberación sináptica.

Las Propiedades De Tipo Salvaje Y Fluorescente Canal Proteína Marcada Con El Ratón De Sodio Resistentes a Tetrodotoxina (Na V 1.8) Heterologously Expresó En Ratas Las Neuronas Simpáticas

Journal of Neurophysiology. Apr, 2008  |  Pubmed ID: 18272876

La tetrodotoxina (TTX) resistente Na (+) de corriente derivada de Na (V) 1.8 que contienen canales participa en las vías nociceptivas, pero es difícil de expresar funcionalmente en los tradicionales sistemas heterólogos. Aquí, mostramos que la inyección de cDNA que codifica el ratón Na (V) 1,8 en los núcleos de la rata del ganglio cervical superior (SCG) en las neuronas resultados TTX resistentes Na (+) corrientes con amplitudes iguales o superiores a las corrientes que surgen de forma nativa los canales de expresión del ratón ganglio de la raíz dorsal (GRD) neuronas. Las propiedades de activación e inactivación de la heteróloga expresada Na Na (V) 1,8 (+) canales fueron similares pero no idénticas a nativos TTX resistentes a los canales. En particular, el potencial de semi-activación de los heteróloga expresadas Na (V) 1.8 canales se desplazó unos 10 mV hacia potenciales más despolarizadas. La fusión de las proteínas fluorescentes a la N-o C-terminal de Na (V) 1,8 no afectó sustancialmente a la expresión funcional de las neuronas SCG. Inesperadamente, la fluorescencia no se concentró en la membrana plasmática pero se encontró en todo el interior de la neurona en un patrón granular. Un patrón de expresión similar se observó en las neuronas ganglio nudoso que expresan los canales etiquetados. En contraste, la expresión de etiquetado Na (V) 1,8 en células HeLa reveló un patrón de fluorescencia en consonancia con el secuestro en el retículo endoplásmico, lo que proporciona una base para la expresión funcional de los pobres en las líneas celulares clónicas. Nuestros resultados establecen neuronas SCG como un sustituto favorable para la expresión y el estudio de molecularmente definidos Na (V) 1,8 contienen canales. Los datos también indican que los factores identificados pueden ser necesarios para la expresión eficaz funcional de Na (V) 1,8 con un fenotipo biofísico idéntica a la encontrada en las neuronas sensoriales.

Identificación De La Neurona Sensorial Específica Región Reguladora Del Gen De Ratón Que Codifica El Canal De Sodio Dependientes De Voltaje NaV1.8

Journal of Neurochemistry. Aug, 2008  |  Pubmed ID: 18466327

Voltaje canales de sodio (VGSC) son componentes críticos de membrana que participan en la actividad eléctrica de las células excitables. El tipo de una familia VGSC incluye el canal de sodio tetrodotoxina insensible, Na (V) 1,8, codificada por el gen Scn10a. Na (V) 1,8 expresión está restringida a pequeñas y medianas diámetro neuronas sensoriales nociceptivas de los ganglios de la raíz dorsal y los ganglios sensoriales craneal. Para comprender la regulación estricta transcripcional del gen Scn10a, el promotor sensorial neurona específica fue identificado funcionalmente. Si bien la identificación del ARNm extremo 5 ', corte y empalme alternativo dentro de la 5'-UTR se observó para crear heterogeneidad en la transcripción del ARN. Cuatro kilobases de DNA genómico aguas arriba fue clonado y la presencia de la actividad del promotor específico de tejido fue probado por microinyección y la infección por adenovirus de fluorescentes construcciones proteína indicadora en principal del ratón y neuronas de rata, y líneas celulares. La región contiene muchos supuestos de unión del factor de transcripción sitios y fuerte homología con la rata ortholog previsto. Homología con la ortholog predicho humana estaba limitado al extremo proximal y varios elementos cis conservados se observaron. Dos módulos de regulación fueron identificados por la microinyección de reportero construye en ganglios de la raíz dorsal y superiores neuronas de los ganglios del cuello uterino: una neurona específica región promotora proximal entre -1,6 y -0,2 kb del cluster de la transcripción de inicio del sitio, y una distal región de la neurona sensorial interruptor más allá de -1,6 kb que la expresión de la proteína fluorescente restringido a un subconjunto de neuronas sensoriales primarias.

Modificación Rápida De Proteínas Utilizando Una Rapamicina-inducible Del Grabado Del Tabaco Del Sistema De La Proteasa Del Virus

PloS One. 2009  |  Pubmed ID: 19830250

La capacidad de alterar la función de una proteína específica en una escala de tiempo rápida proporciona una poderosa herramienta para la investigación biomédica. Proteasas específicas proporcionar un método potencial para escindir selectivamente una proteína elegido, pero el control rápido de la actividad de la proteasa es difícil.

Reconstrucción Molecular De La Cascada Endocannabinoide MGluR5a Señalización Mediada Por Neuronas De Rata Simpáticas Individuales

The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. Oct, 2009  |  Pubmed ID: 19864572

Los endocannabinoides (BCE) como el 2-araquidonilglicerol (2-AG) son metabolitos de los lípidos que se sintetizan en unos neuronas postsinápticas y actuar sobre CB (1) los receptores cannabinoides (CB (1) R) en las terminales nerviosas presinápticas. Esta transmisión retrógrada subyace a varias formas de corto y largo plazo, la plasticidad sináptica en el SNC. Aquí, hemos construido un modelo de sistema basado en las neuronas simpáticas de rata aislados, en los que podría ser una cascada de señalización del BCE estudian en un sistema reducido, espacialmente compacta y maleable genéticamente. Hemos construido una completa BCE producción / movilización vía por la adición secuencial de los componentes moleculares. Expresión heteróloga de cuatro componentes se requiere para la producción del BCE y la detección de: 5a metabotrópicos receptores de glutamato (mGluR5a), Homero 2b, diacilglicerol lipasa alfa, y CB R. (1) En estas neuronas, la aplicación de L-glutamato dependiente de la tensión producida modulación de tipo N de Ca (2 +) canales mediadas por la activación de CB (1) R. Utilizando tanto disección molecular y agentes farmacológicos, que proporcionan evidencia de que la activación de los resultados en la producción rápida mGluR5a enzimática de 2-AG seguido por la activación de CB (1) R. Estos experimentos definir los elementos críticos necesarios para recapitular retrógrada de producción BCE y de señalización en una neurona periférica única. Por otra parte, la producción / la movilización del BCE se pueden detectar en una escala de tiempo fisiológicamente relevantes usando técnicas electrofisiológicas. El sistema proporciona una plataforma para probar las moléculas candidatas que subyacen a la facilitación del BCE transporte a través de la membrana plasmática.

Un Método Simple, Altamente Eficiente Para La Expresión Heteróloga En Mamíferos Neuronas Primarias, Utilizando Lípidos Catiónicos Transfección Mediada ARNm

Frontiers in Neuroscience. 2010  |  Pubmed ID: 21267423

Expresión de proteínas heterólogas en adultos neuronas de mamíferos es una técnica valiosa para el estudio de la función neuronal. La naturaleza post-mitótica de las neuronas maduras evita que la transfección de ADN eficaz usando simples, basadas en lípidos catiónicos métodos. Expresión adecuada de proteína heteróloga es a menudo sólo puede lograrse utilizando técnicas complejas que, en muchos casos, están asociados con la toxicidad sustancial. Aquí, un método simple para la transfección de alta eficiencia de mamíferos utilizando neuronas primarias en el ARNm transcrito in vitro y la transfección catiónico lípidos Lipofectamine reactivo ™ 2000 se describe. Las condiciones óptimas de transfección se establecieron en el ratón adulto disociado ganglio de la raíz dorsal (DRG) neuronas usando un ensayo de luciferasa actividad 96-bien basado. Usando estas condiciones, una eficacia de transfección de 25% se consiguió en DRG neuronas transfectadas con ARNm EGFP. Altas eficiencias de transfección se obtuvieron también en disociadas de ratas superiores cervicales ganglionares (SCG), las neuronas corticales y las culturas del ratón y del hipocampo. Endógena de Ca (2 +) corrientes en las neuronas EGFP SCG transfectadas ARNm-no fueron significativamente diferentes de las neuronas no transfectadas, lo que sugiere que esta técnica es muy adecuado para la expresión heteróloga en experimentos de parches de grabación con la pinza. La expresión funcional de un receptor cannabinoide (CB1R), una proteína G por dentro rectificación de K (+) canal (GIRK4) y una proteína dominante negativo G α-subunidad mutante (G (OA) G203T) indican que los niveles de expresión de la proteína heteróloga posible utilizando la transfección ARNm son adecuados para estudios de proteínas más funcionales. Este estudio demuestra que la transfección de ARNm es un método sencillo y eficaz para la expresión heteróloga en las neuronas y es probable que tenga muchas aplicaciones en la investigación de la neurociencia.

Identificación Y Modulación Del Voltaje-dependientes De Ca2 + En El Pez Cebra Corrientes Beard Rohon-neuronas

Journal of Neurophysiology. Jan, 2011  |  Pubmed ID: 20962070

Células eléctricamente excitables tienen dependientes de voltaje canales de iones en la membrana plasmática que regulan permeabilidad de la membrana a los iones específicos. Voltaje de Ca (2 +) canales (VGCCs) son especialmente importantes como Ca (2 +) sirve como un portador de carga y el segundo mensajero. El pez cebra (Danio rerio) es un vertebrado importante modelo para el estudio de la excitabilidad neuronal, circuitos, y el comportamiento. Sin embargo, las propiedades electrofisiológicas de VGCCs pez cebra siguen siendo en gran parte inexplorado debido a una preparación adecuada para las células de fijación de voltaje se carece de estudios. Beard Rohon (RB) neuronas sensoriales representan un candidato atractivo para este fin debido a su relativamente grande y somata homología funcional a los ganglios de la raíz dorsal de mamíferos (GRD) neuronas. Pez cebra transgénico que expresa la proteína verde fluorescente en RB neuronas, (Isl2b: EGFP) (ZC7), se utilizaron para identificar las neuronas disociadas adecuados para células enteras patch-clamp experimentos. Sobre la base de las propiedades biofísicas y farmacológicas, el pez cebra neuronas RB expresar tanto de alta y baja tensión gated-Ca (2 +) actual (HVA y LVA-I (Ca), respectivamente). Ni (+)-sensible LVA-I (Ca) se producen en la minoría de RB neuronas (30%) y ω-conotoxina GVIA sensible Ca (V) 2,2 (tipo N) de Ca (2 +) canales subyacen a la gran mayoría (90%) de HVA-I (Ca). Para identificar los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) que modulan la HVA-I (Ca), un grupo de neurotransmisores se proyectó. Aplicación de GABA / baclofeno o serotonina produjo una inhibición dependiente de la tensión mientras que la aplicación de la DAMGO agonista mu-opioide resultó en una inhibición de voltaje independiente. A diferencia de las neuronas de mamíferos, GRCP mediada dependiente de la tensión de modulación de I (Ca) parece ser transducidas principalmente a través de una toxina del cólera sensible subunidad Gα. Estos resultados proporcionan la base para utilizar el sistema de modelo de pez cebra a la comprensión de Ca (2 +) la función del canal, ya su vez, la forma de Ca (2 +) canales de contribuir a la función mecanosensorial.