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Articles by Swiderski Piotr in JoVE
JoVE Immunology and Infection
Sviluppo di Cell-tipo specifico anti-HIV gp120 aptameri per la consegna di siRNA
1Department of Molecular and Cellular Biology, Beckman Research Institute of City of Hope, 2Graduate School of Biological Sciences, Beckman Research Institute of City of Hope, 3Shared Resource-DNA/RNA Peptide, Beckman Research Institute of City of Hope
Diversi 2'-Fluoro aptameri contro l'HIV-RNA 1BA-L gp120 con nanomole affinità sono isolati da una libreria di RNA
Other articles by Swiderski Piotr on PubMed
Troncato Di Amplificazione: Un Metodo Per L'amplificazione Dell'acido Nucleico Modello-driven Ad Alta Fedeltà
Il tasso di errore di PCR convenzionale è problematico quando amplificando da cellule singole o amplificare segmenti per l'analisi funzionale della proteina di traduzione in vitro. Descriviamo amplificazione troncato, un metodo per l'amplificazione ad alta fedeltà in cui DNA polimerasi errori non vengono propagate in modo efficiente e modelli del DNA originale esercitano una maggiore influenza sul processo di amplificazione. Amplificazione troncati utilizza coppie di oligonucleotidi e termali in bicicletta, ma differisce dalla PCR. Troncato amplificazione amplifica esponenzialmente non con uno o due oligonucleotidi chimerici e produce prodotti terminale troncati che sono non più di tre giri di replica dal modello originale. Esone 6 del gene p53 è stato utilizzato come sistema di modello per dimostrare la prova del principio. Chimerici oligonucleotidi contenenti tre 3'--> 5' invertita-deoxynucleotides o 2'--OMe ribonucleotidi a 6-8 nucleotidi dal 3 ' capolinea mantenuto attività sequenza specificità e primer extension. Con PfuTurbo, ma non con le polimerasi di Taq o DNA Vent (exo-), i nucleotidi modificati completamente troncato l'allungamento della polimerasi del DNA. I prodotti terminali troncati risultanti non sono modelli per ulteriore amplificazione a causa della breve lunghezza della regione 3' complementari. Amplific troncato ation può amplificare quadraticamente o geometricamente a seconda se vengono utilizzati uno o due oligonucleotidi chimerici. Amplificazione troncato è un promettente approccio quando modello-driven amplificazione è voluta per aumentare la frequenza di prodotti privi di errore.
Analisi Mobilità-shift Con Chip Microfluidici
Analisi di spostamento di mobilità elettroforetica (EMSA) sono una tecnica ben caratterizzata e ampiamente utilizzata per l'analisi dell'interazione proten-DNA e l'analisi di calcolo combinatorio di fattore di trascrizione. Attualmente implementato EMSA generalmente implica l'uso che richiede tempo di elettroforesi del DNA e del gel di poliacrilammide radioattivo. Stiamo studiando la bionanoscience delle nanostrutture proteina nucleico supramolecolari auto-assemblanti. Abbiamo intrapreso questi studi perché promettono di migliorare la nostra comprensione delle assemblee formate durante l'evoluzione prebiotica, forniscono strumenti per l'analisi dei processi biologici come ricombinazione del DNA e possono portare allo sviluppo di biosensori su scala nanometrica, progettato per il targeting molecolare site-specific. Nel corso di questo lavoro, abbiamo notato che l'EMSA di queste strutture complesse potrebbe essere attuato efficacemente con chip microfluidici progettate per la separazione di frammenti di DNA. In questa relazione noi confrontare le due tecniche e dimostrare che il sistema di microfluidica è anche in grado di risolvere complesse miscele prodotte dalla decorazione prodotti intermedi di ricombinazione del DNA con miscele di proteine leganti il DNA. Inoltre, il sistema di chip microfluidici migliora l'EMSA consentendo analisi con piccoli campioni, evitando l'uso di radiolabeling, e riducendo il tempo coinvolti in una manciata di minuti.
Costruzione Di Matrici Di Proteina Ordinato
Le schiere della proteina artificialmente ordinata forniscono un facile approccio a una varietà di problemi in biologia e nanoscienze. Attuali sistemi di dimostrazione utilizzano attacchi di acido nucleico o metiltransferasi fusioni al fine di indirizzare le proteine o peptidi di interesse per l'acido nucleico ponteggi. Queste dimostrazioni punto per il gran numero di dispositivi utili e gli assembly che possono essere immaginati utilizzando questo approccio, tra cui smart sonde biologiche e sistemi di somministrazione farmacologica. In linea di principio, questi sistemi sono ora in grado di imitare le prime forme di organismi prebiotici e possono essere previsto per raggiungere la complessità di un piccolo virus in un prossimo futuro. Inibitori della terzo-generazione metiltransferasi forniscono un esempio di un chemotherapeutics intelligente che può essere costruito con questo approccio. Descriviamo l'uso meccanicistico alla classe delle transferasi, computer-aided design e elettroforesi capillare basato su chip microfluidici nel valutare l'assemblaggio finale e la sperimentazione di progetti di questo tipo.
Proinfiammatorie Effetti Dei Prodotti Finali Lipoxidation Avanzate Nei Monociti
Le reazioni dei carboidrati-lipidi derivati o prodotti intermedi con proteine portano alla formazione di prodotti di reazione di Maillard, che successivamente conduce alla formazione di avanzati prodotti finali di glicazione/lipoxidation (età/ALEs). Livelli di età/ALEs sono aumentati in malattie come il diabete. A differenza di età, molto poco si sa circa gli effetti ALE in vitro. Abbiamo ipotizzato che ALEs può avere effetti proinfiammatori nei monociti.
Effetti Della RNAs D'interferenza Piccolo Colesterolo-Tag Targeting Per 12/15-lipossigenasi Sui Parametri Della Nefropatia Diabetica in Un Modello Murino Di Diabete Di Tipo 1
Abbiamo precedentemente dimostrato che il 12/15-lipossigenasi (12/15-LO) pathway dell'arachidonato metabolismo acido è coinvolto in più eventi correlati a nefropatia diabetica (DN), tra cui l'ipertrofia glomerulare e la deposizione di matrice extracellulare (SW Kang, Adler SG, Nast CC, LaPage J, Gu JL, Nadler JL, R. Natarajan Kidney Int 59:1354-1362, 2001; Kang SW, Natarajan R, A Viviana, Nast CC, LaPage J, Mundel P, C Kashtan, Adler SG. J Am Soc anche 14:3178-3187, 2003; Kim YS, Lanting L, Adler SG, R. Natarajan Kindney Int 64:1702-1714, 2003; MA Reddy, Adler SG, Kim YS, Lanting L, Rossi JJ, Kang SW, Nadler JL, A Viviana, Natarajan R. Am J Physiol renale Physiol 283: F985-F994, 2002). In questo studio, abbiamo valutato se consegna in vivo di piccoli RNA interferenti (siRNA) targeting per 12/15-LO può migliorare il danno renale e DN in un modello murino streptozotocin-iniettato del diabete di tipo 1. Per ottenere maggiore accesso in vivo e siRNA espressione nel rene, abbiamo usato double-stranded 12/15-LO siRNA oligonucleotides coniugati con il colesterolo. DBA/2J topi diabetici erano iniettati per via sottocutanea con colesterolo-tagged 12/15-LO siRNA, siRNA controllo non corrispondenti o veicolo da solo, due volte settimanali per 7 settimana relativa ai controlli, topi che hanno ricevuto 12/15-LO siRNA ha mostrato significativa riduzione nella albuminuria, rapporti di peso del rene-a-corpo, espansione matrice mesangiale glomerulare, danni strutturali renali e infiltrazione di monociti/macrofagi. Questi effetti sono stati associati con livelli renali corticali o glomerulari inferiori dei marcatori profibrotic trasformando growth factor-beta, fattore di crescita del tessuto connettivo, tipo I e tipo IV collageni, dell'inibitore dell'attivatore del plasminogeno 1 e fibronectina. L'aumento del diabete indotto gli inibitori di chinasi ciclina-dipendente glomerulare che sono associati con ipertrofia è stato impedito anche dall'amministrazione del siRNA. I nostri risultati mostrano per la prima volta che consegna sistemico di colesterolo-tagged siRNAs targeting per 12/15-LO ha effetti renoprotettive condizioni diabetica e quindi potrebbe essere un nuovo approccio terapeutico per DN.
Selezione, Caratterizzazione E Applicazione Del Nuovi RNA HIV Gp 120 Aptameri Per Facile Consegna Della Cubettatrice Substrato SiRNAs in HIV Infetta Le Cellule
La glicoproteina busta del virus dell'immunodeficienza umana (HIV) è costituito da una glicoproteina esterno (gp120) e un dominio trans-membrana (gp41) e ha un ruolo importante in entrata virale in cellule. Entrata HIV-1 è stato convalidato come una strategia anti-virale clinicamente rilevante per la scoperta della droga. Nel presente lavoro, più 2'-F sostituito RNA aptameri che si legano alla proteina gp120 HIV-1(BaL) con affinità nanomole sono stati isolati da una libreria di RNA dalla procedura SELEX (evoluzione sistematica dei ligandi di arricchimento esponenziale). Da due di questi aptameri abbiamo creato una serie di nuovi doppia funzione inibitoria anti-gp120 aptamer-siRNA chimere. Le chimere aptamer-siRNA e aptameri specificamente legano e vengono interiorizzate in cellule che esprimono l'HIV gp160. La cubettatrice-substrato siRNA consegnato dagli aptameri funzionalmente elaborato da Dicer, con conseguente inibizione specifica della replicazione dell'HIV-1 e l'infettività in CEM T-cellule coltivate e cellule mononucleari del sangue primario (PBMCs). Inoltre, abbiamo introdotto una sequenza 'appiccicosa' su un aptamer chimicamente sintetizzato che facilita l'attaccamento del cubettatrice substrato siRNA per potenziali multiplexing. I nostri risultati forniscono una serie di nuovi agenti inibitori per bloccare la replicazione dell'HIV e convalidare ulteriormente l'utilizzo di aptameri per la consegna della cubettatrice substrato siRNA.
Consegna in Vivo Di SiRNA Alle Cellule Immunitarie Di Coniugazione Di Un Agonista TLR9 Migliora La Risposta Immunitaria Antitumorale
Consegna efficiente dei piccoli interferenti (si) RNA a popolazioni di cellule specifiche in vivo rimane una sfida formidabile successo dell'applicazione terapeutica. Mostriamo che siRNA sinteticamente collegato a un agonista di oligonucleotidi CpG del recettore toll-like (TLR) 9 geni target e silenzi in TLR9(+) cellule mieloidi e le cellule B, entrambi dei quali sono componenti chiave del microambiente del tumore. Quando un siRNA CpG-coniugati che gli obiettivi del gene soppressore immune che STAT3 è iniettato in topi localmente presso il sito del tumore o per via endovenosa, entra nel tumore-associati delle cellule dendritiche, macrofagi e cellule B. Silenziamento di Stat3 porta all'attivazione delle cellule del sistema immunitario associato al tumore e in definitiva a potente risposta immunitaria antitumorale. I nostri risultati dimostrano che il potenziale dei TLR agonisti-siRNA coniugati per silenziamento genico mirato accoppiato con attivazione di stimolazione e immunitario TLR nel microambiente del tumore.
Stabilità Del Tioestere Intermedi Nelle Modifiche Di Ubiquitin-like
Ubiquitin-come modifiche sono importanti meccanismi di regolazione cellulare e vengono effettuate attraverso diversi passaggi con prodotti intermedi di reazione essendo tioestere coniugati delle proteine ubiquitina-come con E1, E2 ed E3 talvolta. Nonostante la loro importanza, una caratterizzazione approfondita della intrinseca stabilità di questi intermedi tioestere è stato carente. In questo studio, abbiamo studiato la stabilità intrinseca utilizzando un modello composto e il Ubc9 circa SUMO-1 tioestere coniugato. Il Ubc9 circa SUMO-1 tioestere intermedio ha un'emivita di circa 3,6 h (idrolisi tasso k = 5,33 + 2,8 x10(-5) s(-1)) e la stabilità è leggermente diminuito sotto condizioni di denaturazione (k = 12.5 + 1,8 x 10(-5) s(-1)), che indica un moderato effetto del contesto strutturale tridimensionale sulla stabilità di questi intermedi. Associazione a E3 attivi e inattivi, (RanBP2) ha anche solo un moderato effetto sul tasso di idrolisi (13,8 + /-0,8 x 10(-5) s(-1) per l'E3 attivo versus 7,38 + 0,7 x 10(-5) s(-1) per l'E3 inattivo). L'intrinseca elevata stabilità di questi intermedi suggerisce che tioestere indesiderati intermedi possono essere eliminati enzimaticamente, tali come da thioesterases, a regolare la loro intracellulare abbondanza e il traffico nel controllo delle modifiche di ubiquitin-like.
Una Chimera Aptamer-siRNA Sopprime Carichi Virali Di HIV-1 E Protegge Dal Declino Di Cellule Helper T CD4(+) Nel Topo Umanizzato
Strategie terapeutiche progettati per trattare l'infezione da HIV con combinazioni di farmaci antivirali hanno dimostrato di essere l'approccio migliore per rallentare la progressione verso l'AIDS. Nonostante questo progresso, non ci sono problemi con la resistenza ai farmaci virali e tossicità, che necessita di nuovi approcci per combattere l'infezione da HIV-1. Abbiamo quindi sviluppato un approccio differente combinazione per il trattamento dell'infezione da HIV in cui un aptamer di RNA, con affinità di legame ad alta per l'HIV-1 (gp120) proteine e virus neutralizzazione proprietà della busta, è associata a e offre un piccolo RNA interferente (siRNA) che innesca la degradazione di sequenza-specifici di HIV RNA. Abbiamo testato l'attività antivirale di questi chimerici RNAs in un modello di mouse Rag2(-/-)γc(-/-) (RAG-hu) umanizzato con ematopoiesi umana multilineare. In questo modello animale, replica di HIV-1 e deplezione delle cellule T CD4(+) imitare la situazione vista in pazienti affetti da HIV umani. I nostri risultati mostrano che trattamento con l'anti-gp120 aptamer o aptamer-siRNA chimera soppressa la replicazione dell'HIV-1 da parecchi ordini di grandezza e ha impedito il declino di cella CD4(+) T helper virale indotta. In confronto la aptamer da solo, la combinazione aptamer-siRNA fornito inibizione più estesa, con conseguente un significativamente più effetto antivirale che esteso parecchie settimane oltre l'ultima dose iniettata. La aptamer agisce così come un agente neutralizzante l'HIV ad ampio spettro e un veicolo di consegna siRNA. L'agente combinato aptamer-siRNA fornisce un approccio terapeutico attraente, non tossico per il trattamento dell'infezione da HIV.
Umanizzato Anticorpo Specifico Lewis-Y Basato Su Consegna Di STAT3 SiRNA
L'applicazione clinica di siRNA è limitato in gran parte dalla mancanza di sistemi di consegna efficiente, cellula-specifico. Gli anticorpi sono veicoli di consegna attraente per una terapia mirata a causa della loro alta specificità. In questo studio, descriviamo l'uso di un anticorpo monoclonale umanizzato (mAb), hu3S193, contro Lewis-Y (Le(y)), come un veicolo di consegna per STAT3 siRNA. Questa mAb è rapidamente interiorizzato in Le (y)-esprimendo il cancro cellule tramite riconoscimento dell'antigene, e quando accoppiato a STAT3 siRNA, viene creato un potenzialmente potente agente di recapito molecolarmente mirati. Silenziamento selettivo di STAT3 è associato con soppressione del tumore. Due hu3S193 basata siRNA sistemi di consegna utilizzando siRNA STAT3 come un prototipo furono sviluppati e testati in Le (y)-cellule tumorali positive: un costrutto covalente basato su un linker disolfuro riduttiva che dovrebbe subire scissione all'interno di cellule e (b) un costrutto non covalente basato su (hu3S193 d-arginine)(9) (9r) modificato. Le (y)-legame specifico e interiorizzazione dei costrutti covalenti e non covalenti sono stati confermati da citometria a flusso e microscopia confocal. Il covalenti e non covalente sistema portò alla efficiente STAT3 tacere in cellule di cancro negativo - cellule di cancro positivo (A431) ma non Le (y) - Le (y) (MDA-MB-435). Il costrutto covalente, tuttavia, necessaria co-treatment con reagenti come la clorochina o 9r che facilitano la fuga del siRNA dalla endosomes per raggiungere il silenziamento genico significativo. Il 9r modificato non covalenti costrutto indotto ∼70% atterramento di STAT3 a concentrazioni di siRNA submicromolar quando viene utilizzato in un rapporto ottimale del veicolo-siRNA di 5:1. L'atterramento di STAT3 ha portato anche a ∼50% inibizione della proliferazione delle cellule di Le (y)-cellule positive. Non covalenti collegato STAT3 siRNA-hu3S193 ha grande promessa per atterramento mirato di STAT3 in cellule tumorali.
Somministrazione Sistemica Di Combinatoria DsiRNAs Tramite Nanoparticelle Sopprime Efficientemente Infezione HIV-1 Nei Topi Umanizzati
Abbiamo valutato l'efficacia in vivo di dendrimeri PAMAM cationico, strutturalmente flessibile come un piccolo sistema di consegna d'interferenza RNA (siRNA) in un Rag2 (-) / - γc-/-modello murino umanizzato (RAG-hu) per l'infezione da HIV-1. Infezione da HIV umanizzati Rag2-/-γc-/-mice (RAG-hu) sono stati iniettati per via endovenosa (i.v.) con nanoparticelle dendrimero-siRNA composto da un cocktail di cubettatrice substrato siRNA (dsiRNAs) targeting trascrizioni virali e cellulari. Riportiamo in questo studio che il trattamento dendrimero-dsiRNA soppresso l'infezione da HIV-1 da parecchi ordini di grandezza e protetto contro virale indotta deplezione CD4(+) T-cell. Abbiamo dimostrato anche che iniezioni di follow-up della dsiRNAs dendrimero cocktailed seguito rebound virale ha provocato una inibizione totale di titoli di HIV-1. Biodistribuzione studi dimostrano che il dendrimero-dsiRNAs preferenzialmente si accumulano nel fegato e cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) e non presentano alcuna tossicità percepibile. Questi dati dimostrano per la prima volta efficace combinatoria consegna di siRNA anti-host ed - virale per il trattamento di HIV-1 in vivo. L'approccio di consegna dendrimero rappresenta quindi un metodo promettente per consegna sistemica di combinazioni di siRNA per il trattamento dell'infezione da HIV-1.
