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Articles by Swiderski Piotr in JoVE
JoVE Immunology and Infection
siRNA導入のための細胞型に特異的な抗HIV gp120のアプタマーの開発
1Department of Molecular and Cellular Biology, Beckman Research Institute of City of Hope, 2Graduate School of Biological Sciences, Beckman Research Institute of City of Hope, 3Shared Resource-DNA/RNA Peptide, Beckman Research Institute of City of Hope
ナノモル親和性HIV - 1BA - Lのgp120に対するいくつかの2' -フルオロRNAアプタマーは、RNAのライブラリーからで隔離されています
Other articles by Swiderski Piotr on PubMed
切り捨て増幅: 忠実度の高いテンプレート駆動型核酸増幅法。
単一の細胞から増幅または増幅タンパク質機能解析による in vitro 翻訳セグメントするとき従来の PCR のエラー率は問題があります。切り捨てられた増幅、どの DNA ポリメラーゼのエラー効率的に伝播されない忠実度の高い増幅用のメソッドを記述してオリジナルの DNA テンプレート増幅過程より大きな影響力を行使します。切り捨てられた増幅オリゴヌクレオチドと熱循環のペアを利用がからの PCR とは異なります。切り捨てられた増幅は 1 つまたは 2 つのキメラ オリゴヌクレオチドの非指数関数的増幅、レプリケーション元のテンプレートからの 3 人以上のラウンドは切り捨てられた端末の製品を生成します。エクソン p53 遺伝子の 6 原則の証拠を示すために、モデル システムとして利用されました。3 つを含むキメラのオリゴヌクレオチド--> 3'5 '逆 deoxynucleotides または 2'--青梅リボヌクレオチド 3 から 6 8 ヌクレオチドで' 末端保持シーケンスの特異性とプライマーの普及活動。PfuTurbo が Taq またはベント (エキソ-) DNA ポリメラーゼではなく、変更のヌクレオチドは完全に DNA ポリメラーゼの伸長を切り捨てください。結果切り捨てられた端末製品は、さらに増幅用テンプレート 3' 相補的な領域の短い長さのためがありません。切り捨てられた amplific 情報は 2 つまたは 1 つのキメラ オリゴヌクレオチドを使用しているかに応じて二次または幾何学的を増幅できます。テンプレート駆動型増幅周波数エラー フリー製品の増加が望まれるとき切り捨てられた増幅有望なアプローチです。
移動性シフト解析マイクロ流体チップを搭載。
電気泳動の移動性シフト解析 (EMSA) DNA 26arc-7 タンパク質相互作用の解析と転写因子の組み合わせ論の分析のためよく特徴付けと広く使われているテクニックです。現在実装 EMSA は一般的に放射性標識 DNA とポリアクリルアミドゲル電気泳動の時間がかかる使用を含みます。我々 は自己組織化超分子タンパク質-核酸ナノ構造のナノバイオサイを勉強しています。我々 は、これらの研究は前生物進化の過程で形成されたアセンブリの私達の理解を高めるために約束するので DNA 組換えのような生物学的プロセスの解析ツールを提供し、部位特異的分子標的のために設計されたナノスケールのバイオ センサーの開発につながる可能性がありますを実施しています。その作業の過程で、EMSA これら複雑な構造の DNA のフラグメントの分離用マイクロ流体チップを効果的に実装できなかったことを指摘しました。本報告では、2 つの技法を比較し、マイクロ流体システムも複雑な混合物の混合による DNA 結合蛋白質の DNA 組換え中間体を飾ることによって生産を解決できることを示します。また、マイクロ流体チップ システム EMSA カイネティックスの使用を避けより小さいサンプルと分析を許可することによって改善し、分の問題に関与する時間を短縮します。
順序付けられた蛋白質のアレイの構築。
人工的に順序付けられた蛋白質のアレイのさまざまな生物学及びナノサイエンスに問題への安易なアプローチを提供します。現在のデモンストレーション システムを使用して核酸テザーまたはメチルトランスフェラーゼの融合のためにターゲット蛋白質またはペプチド核酸足場に関心のあります。これらのデモンストレーションは、有用なデバイスとスマートの生物学的プローブと薬物送達システムなどを含むこのアプローチを使用して想像できるアセンブリの多数にポイントします。原則として、これらのシステムはプレバイオティクス生物の初期の形態を模倣するが可能になりました、小さなウイルスの複雑さを近い将来に到達する期待できます。第 3 世代メチル基転移酵素阻害剤はこのアプローチで構築することができますスマート化学療法剤の例を示します。我々 は、機械的な酵素学、コンピューター支援設計、最終的なアセンブリを評価およびテストのこのタイプの設計でマイクロ流体チップに基づいてキャピラリー電気泳動の使用について説明します。
高度な Lipoxidation エンド製品単球の炎症誘発効果。
反応中間体の蛋白質と炭水化物や脂質由来の後の形成には、高度な糖化/lipoxidation エンド製品 （年齢/エール) つながるメイラード反応生成物の形成に します。糖尿病のような疾患は、年齢/エールのレベルが増加しています。年齢層とは異なり、ほとんどエール効果について in vitro で知られています。エールが単球炎症誘発効果を持つことができることを仮定しました。
12/15-リポキシゲナーゼ パラメーター糖尿病性腎症 1 型糖尿病のマウスモデルのターゲティング コレステロール付いた小さい干渉の RNAs の効果。
我々 は以前、12/15-リポキシゲナーゼ (12/15-LO) 経路のアラキドン酸代謝の糸球体の肥大や細胞外マトリックスの沈着など糖尿病性腎症 (DN)、関連する複数のイベントに関与していることを示した (カン SW、アドラー SG、コンデナスト CC、LaPage J、Gu JL、ナドラー JL ナタラジャン R. 腎臓 Int 59: 1354年-1362, 2001;カン SW、ナタラジャン R、Shahed A、コンデナスト CC、LaPage J、マンデル Kashtan C P アドラー SG。J 午前 Soc Nephrol 14:3178 3187 2003;キム YS ランティング L アドラー SG、ナタラジャン R. にその Int 64: 1702年-1714年, 2003;・ レディ MA、アドラー SG、キム YS、ランティング L、ロッシ JJ、カン SW、ナドラー JL、Shahed A、ナタラジャン R. 午前 J の生理腎生理 283: F985 F994, 2002年)。本研究では, 12/15-LO ターゲティング in vivo での配信小さい干渉の RNAs (Sirna) の腎障害と DN 1 型糖尿病のストレプトゾトシン投与マウス モデルで改善できるかどうかを検討しました。In vivo でのアクセスと腎臓における siRNA 発現を実現するには、コレステロールを共役二重鎖 12/15-LO siRNA オリゴヌクレオチドを使用しました。糖尿病の DBA/2 j マウス皮下 12/15-LO siRNA コレステロール タグ、不一致対照 siRNA または車両単独での 2 回毎週 7 wk. 相対のコントロールを受け取った 12/15-LO siRNA 蛋白尿、腎臓体重比, 糸球体メサンギウム マトリクス拡張, 腎の構造的損傷と単球/マクロファージ浸潤の重要な減少を示したマウス注入されました。これらの効果は腎皮質あるいは糸球体の低レベルの結合組織成長因子成長因子 β profibrotic マーカーと関連付けられた、類および IV 型コラーゲン, プラスミノーゲン ・ アクチベータ ・ インヒビター 1 とフィブロネクチンを入力します。肥大症に関連付けられている糸球体サイクリン依存性キナーゼ阻害薬の糖尿病誘発増加はまた siRNA 投与によって防がれました。我々 の結果初めて全身 siRNAs の配達の 12/15-LO ターゲティング コレステロール付いた doca-nacl 糖尿病条件下でありしたがって DN に対する新規な治療アプローチをことができることを示します。
HIV感染細胞にダイサー基板siRNAの簡便な配信のための新しいRNA HIV Gpの120アプタマーの選択、キャラクタリゼーションと応用
ヒト免疫不全ウイルスのエンベロープ糖タンパク質（HIV）は、外部糖タンパク質（gp120の）と膜貫通ドメイン（gp41）を構成され、細胞へのウイルスの侵入に重要な役割を持っています。 HIV-1のエントリは創薬のための臨床的に関連する抗ウイルス戦略として検証されています。本研究では、いくつかは、2'-Fに結合するRNAアプタマーを置換HIV-1（BAL）ナノモル親和性を有するgp120タンパク質は、SELEX（指数濃縮によるリガンドの系統的進化）の手順でRNAライブラリーから単離した。これらのアプタマーの2つから我々は、新しいデュアル阻害機能抗gp120のアプタマー、siRNAのキメラのシリーズを作成しました。アプタマーおよびアプタマー、siRNAのキメラは、特異的に結合し、HIV gp160を発現する細胞に内在化されています。アプタマーが提供するダイサー基板のsiRNAは、機能的に培養されたCEM T細胞および一次血単核細胞（PBMC）におけるHIV-1複製および感染の特異的阻害の結果、ダイサーによって処理されます。さらに、潜在的な多重化のためのダイサー基板siRNAの添付ファイルを容易に化学的に合成されたアプタマーの上に "スティッキー '配列を導入しています。我々の結果は、HIV複製を阻止するための新規な阻害剤のセットを提供し、さらにダイサー基板siRNAの送達のためのアプタマーの使用を検証します。
TLR9アゴニストの結合により免疫細胞へのsiRNAのインビボ送達において抗腫瘍免疫応答を強化
in vivoでの特定の細胞集団に小さな干渉（SI）RNAの効率的な送達は、その成功した治療への応用に手ごわい課題である。私たちは総合的に腫瘍微小環境の主要コンポーネントですどちらもToll様受容体（TLR）9ターゲットと沈黙のTLR9の遺伝子（+）骨髄細胞およびB細胞のCpGオリゴヌクレオチドアゴニストにリンクされているsiRNAを示しています。免疫抑制遺伝子を標的とStat3のCpGをコンジュゲートsiRNAが局所的に腫瘍部位または静脈内投与のいずれのマウスに注入されている場合には、腫瘍関連樹状細胞、マクロファージ、B細胞に入ります。 STAT3のサイレンシングは、腫瘍関連免疫細胞の活性化に、最終的には強力な抗腫瘍免疫応答につながる。我々の調査結果は、TLR刺激と腫瘍微小環境における免疫活性化と相まって、標的遺伝子サイレンシングのTLRアゴニストのsiRNA複合体の可能性を示しています。
ユビキチン様修正チオエステル中間体の安定性。
ユビキチンのような変更は重要な細胞の制御メカニズムを解明する、いくつかの手順を通じてが E1、E2、および時々 E3 とユビキチン様タンパク質のチオエステル抱合されて反応中間体と実施されています。その重要性にもかかわらずはこれらチオエステル中間体の本質的な安定性の徹底的なキャラクタリゼーション欠けていた。本研究では、我々 はモデル化合物と、Ubc9 を使用して組み込みの安定性を検討相撲 1 チオエステル共役約。Ubc9 約相撲 1 チオエステル中間が約 3.6 h の半減 （加水分解率 k 2.8 x10(-5) s(-1)) と条件の変化の下ではやや減少した安定性 ± 5.33 = (k = 12.5 ± 1.8 倍 10(-5) s(-1))、3次元構造コンテキストの適度な効果これらの中間体の安定性を示します。(RanBP2) はアクティブと非アクティブの E3 にバインド、加水分解速度 (0.8 x 10(-5) s(-1) アクティブ E3 7.38 ± 0.7 x 10(-5) s(-1) 非アクティブ E3 の対の ± 13.8） 影響、中程度もあります。その不要なチオエステル中間体可能性があります排除酵素によって、そのような物によってその細胞内調節する thioesterases としては、これらの中間体の本質的に高い安定性を示唆する豊かさとユビキチン様修飾のコントロールで人身売買します。
アプタマー、siRNAのキメラヘルパーCD4からHIV-1ウイルス負荷と保護（+）ヒト化マウスにおけるT細胞の減少を抑制する
抗ウイルス薬の組み合わせでHIV感染を治療するために設計された治療戦略は、エイズへの進行を遅らせるための最善のアプローチであることが判明している。この進歩にもかかわらず、ウイルスの薬剤耐性と毒性の問題は、HIV-1感染症との闘いへの新しいアプローチを必要がある。そこで我々は、HIV-1エンベロープ（gp120の）タンパク質およびウイルス中和プロパティへの高い結合親和性で、RNAアプタマーのHIV感染の治療のためのさまざまな組み合わせのアプローチを開発しているに接続し、低分子干渉RNA（siRNAを提供している）それは、HIV RNAの配列特異的分解をトリガします。我々は、ヒトRAG2で、これらのキメラRNAの抗ウイルス活性をテストしました（ - / - ）γC（ - / - ）多系統のヒト造血と（RAG-HU）マウスモデル。この動物モデルでは、HIV-1複製とCD4（+）T細胞の枯渇は、ヒトのHIV感染患者に見られる状況を模倣する。我々の結果は桁違いによる抗gp120のアプタマーアプタマーまたはsiRNAは、キメラを抑制し、HIV-1複製のいずれかで、その治療を示し、ウイルス誘発性ヘルパーCD4（+）T細胞の減少を防いだ。単独アプタマーと比較して、アプタマー-siRNAの組み合わせは、数週間の最後の注入された用量を超えて拡張したかなり長い抗ウイルス効果が得られ、より広範な阻害を提供した。アプタマーは、このように広いスペクトルのHIV-中和剤およびsiRNA送達ビヒクルとして機能します。組み合わせたアプタマー - siRNAのエージェントは、HIV感染症の治療のための魅力的な、無毒な治療アプローチを提供します。
ヒト化ルイス Y 特異抗体 STAT3 SiRNA の配信をに基づいてください。
SiRNA の臨床応用は大きく、セル固有の効率的な配信システムの欠如によって制限されます。抗体は、その高い特異性による標的療法のための魅力的な配送車です。本研究ではヒト化モノクローナル抗体 (mAb) に対してルイス-Y (STAT3 siRNA の配信手段として Le(y))。 hu3S193 の使用を記述します。この mAb は急速にル （y） に内面化される-表現するがん細胞における抗原認識を介してと STAT3 siRNA に結合とは、潜在的に強力な分子標的配信エージェントが作成されます。選択的 STAT3 のサイレンシングと腫瘍抑制に関連付けられます。STAT3 siRNA をプロトタイプとする 2 つのベース hu3S193 siRNA 配信システム開発、ル (y) をテスト-肯定的な癌細胞： (a) 共有結合コンストラクト細胞および (b) 内胸の谷間を受けると予想です還元二硫化リンカー ベース （上 d-arginine)(9) （9r) 変更 hu3S193 共有的コンストラクトに基づいて。ル （y）-特定のバインドと共有結合と非構造体の内部化が確認されたフローサイトメトリーおよび共焦点レーザー顕微鏡による。共有結合と共有的システム効率的 STAT3 ル (y) - 肯定的な癌細胞 (A431） ではないル （y） が - 否定的な癌細胞 (MDA-MB-435) サイレンシングにつながった。共有結合コンストラクトは、ただし、co-treatment、siRNA の重要な遺伝子サイレンシングを達成エンドソームからの脱出を促進する試薬を用いるクロロキンまたは 9r など必要。9R 変更共有的コンストラクト誘導 ∼70 %stat3 ノックダウン マイクロモル以下 siRNA の濃度で最適車両 siRNA 比 5:1 を使用する場合。STAT3 ノックダウン ル (y) の細胞増殖の阻害率 ∼50 にもつながった-陽性細胞。共有的リンク STAT3 siRNA hu3S193 STAT3 の対象となるノックダウンの偉大な約束に腫瘍細胞があります。
ナノ粒子のViaコンビナトリアルDsiRNAsの全身投与は、効率的にヒト化マウスにおけるHIV-1感染を抑制する
（ - ）/-γC-/ - （RAG-HU）HIV-1感染ヒト化マウスモデル我々は、RAG2の小さな干渉RNA（siRNA）の配信システムとして構造的に柔軟性、カチオン性PAMAMデンドリマーのin vivoでの有効性で評価した。 HIVに感染したヒトRag2-/-γc-/-マウス（RAG-HU）は、両方のウイルスと細胞の転写産物をターゲットとダイサー基板のsiRNA（dsiRNAs）のカクテルで構成されるデンドリマー-siRNAのナノ粒子と（ⅳ）静脈内注射した。我々は、この研究で報告しているデンドリマーdsiRNA処理を抑制し、HIV-1桁違いに感染し、ウイルス誘導CD4（+）T細胞の枯渇から保護されています。また、ウイルスのリバウンド後にデンドリマーcocktailed dsiRNAsのフォローアップの注射がHIV-1抗体価の完全な阻害をもたらしたことを明らかにした。生体内分布の研究はデンドリマーdsiRNAsが優先的に末梢血単核細胞（PBMC）と肝臓に蓄積し、任意の識別可能な毒性を示さないことを示している。これらのデータは、初めての抗ホストとウイルス、in vivoでHIV-1治療のためのsiRNAの有効な組み合わせの配信を示しています。デンドリマー配信のアプローチは、したがって、HIV-1感染症の治療のためのsiRNAの組み合わせの全身送達のための有望な方法を表しています。
