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Articles by Theo van Laar in JoVE
JoVE Clinical and Translational Medicine
Assay Sphéroïde pour mesurer le TGF-β induit Invasion
Un test pour mesurer quantitativement Transforming Growth Factor (TGF)-β-induite invasion dans des gels de collagène en 3 dimensions est décrite. Ce test prend avantage de la série MCF10A de lignées cellulaires, qui représentent les différentes étapes du développement du cancer du sein. Cette méthode peut être adoptée pour être utilisé avec d'autres lignées cellulaires et pourraient être utilisées pour étudier d'autres activateurs ou des inhibiteurs potentiels de l'invasion.
Other articles by Theo van Laar on PubMed
Un Rôle Pour Rad23 Protéines Dans La Dégradation Des Protéines 26S Du Protéasome-dépendante?
Le traitement des cellules avec des agents génotoxiques affecte la dégradation des protéines de façon à la fois positifs et négatifs. L'exposition de S. cerevisiae à l'agent d'alkylation MMS abouti à l'activation de gènes qui sont impliqués dans la dégradation des protéines ubiquitine-protéasome 26S et-dépendante. Ce procédé chevauchement partiel avec l'activation de la voie ER-protéine associée dégradation. La réparation de l'ADN en protéines Rad23p et ses homologues de mammifères ont été montré pour empêcher la dégradation de substrats spécifiques en réponse aux dommages d'ADN. Particulièrement l'inhibition de la dégradation récemment identifié par la souris Rad23 protéines (mHR23) du XPC associé par excision de nucléotides protéine de réparation a été montré pour stimuler l'ADN repair.Recently, il a été montré que Rad23p et l'homologue de la souris mHR23B également associé avec Png1p, une enzyme déglycosylation. Png1p médiée par déglycosylation joue un rôle dans la dégradation des protéines ER-associé, après l'accumulation de protéines malfolded dans le réticulum endoplasmique. Ainsi, si la stabilisation de protéines qui sont associés à l'extrémité C-terminale de Rad23p est un phénomène générale, puis Rad23 peut être impliqué dans la stimulation de la dégradation des protéines ER-associé ainsi. Fait intéressant, le Mif1 protéine récemment identifiée comme HHR23-est aussi pensé pour jouer un rôle dans la dégradation des protéines ER-associé. Le gène MIF1 est fortement activé en réponse à ER-contrainte. Mif1 contient un domaine analogue à l'ubiquitine, qui est très probablement impliqué dans la liaison à S5a, une sous-unité du complexe 19S réglementaire du protéasome 26S. Sur la base de sa localisation dans l'ER-membrane, il est émis l'hypothèse que Mif1 pourrait jouer un rôle dans la translocation du protéasome 26S vers l'ER-membrane, améliorant ainsi la dégradation des protéines ER-associé.
Répression De La Anoïkis Et Induction De Métastases Par Le Récepteur TrkB Neurotrophique
La métastase est un facteur majeur dans la malignité des cancers, et est souvent responsable de l'échec du traitement du cancer. Anoïkis (apoptose résultant de la perte de interactions cellule-matrice) a été proposé d'agir comme une barrière physiologique à la métastase, la résistance aux anoïkis peut permettre la survie des cellules cancéreuses lors de la circulation systémique, ce qui facilite la formation de tumeurs secondaires dans des organes éloignés. Dans une tentative pour identifier les métastases associées oncogènes, nous avons conçu un impartiale, l'échelle du génome écran fonctionnelle uniquement sur la base de la suppression de anoïkis. Nous rapportons ici l'identification de TrkB, un récepteur tyrosine kinase neurotrophique, comme un suppresseur de puissant et spécifique de la caspase-associés anoïkis de non-cellules épithéliales malignes. En activant la phosphatidylinositol-3-OH kinase / protéine kinase B voie, TrkB induit la formation de grands agrégats cellulaires qui survivent et prolifèrent en suspension. Chez la souris, ces cellules se forment rapidement des tumeurs croissantes qui lymphatiques infiltrés et les vaisseaux sanguins pour coloniser des organes éloignés. Conformément à la capacité de TrkB pour supprimer anoïkis, les métastases - si infiltrats de petits bateaux ou des nodules tumoraux grands - contenus très peu de cellules apoptotiques. Ces observations démontrent les effets puissants de TrkB oncogènes et de découvrir un programme spécifique de survie fonction qui peut contribuer à sa capacité métastatique, en fournissant une explication possible de la nature agressive des tumeurs humaines qui surexpriment TrkB.
TEB4 Est Un Anneau C4HC3 Finger Contenant Ubiquitine Ligase Du Réticulum Endoplasmique
Dans la présente étude, l'TEB4 humaine est identifié comme un roman ER (réticulum endoplasmique)-résident ubiquitine ligase. TEB4 a des homologues dans de nombreuses espèces et a un certain nombre de propriétés remarquables. TEB4 contient un noyau conservé (vraiment intéressant nouveau gène) des doigts et 13 domaines transmembranaires prédits. Le RING finger de TEB4 et de ses homologues est situé à l'extrémité N-terminale et a la configuration non conventionnelle C4HC3. L'extrémité N-terminale de TEB4 est situé dans le cytosol. Nous montrons que le domaine RING isolé TEB4 catalyse ligature ubiquitine in vitro dans une réaction qui est l'ubiquitine Lys48-spécifique et implique UBC7 (ubiquitine-enzyme de conjugaison 7). Ces propriétés sont pas sans rappeler des enzymes E3, qui sont impliqués dans la dégradation des protéines ER-associé. TEB4 est un substrat de dégradation ER lui-même, la promotion de sa propre dégradation dans un anneau de doigt et protéasome-dépendante.
Les Mutations Du Domaine Ets PU.1 Sont Spécifiquement Associés à Murin Radio-induite, Mais Non L'homme Liés à La Thérapie, La Leucémie Myéloïde Aiguë
Murin induit par le rayonnement de leucémie myéloïde aiguë (AML) est caractérisée par la perte d'une copie du chromosome 2. Auparavant, nous avons positionné le facteur de transcription essentiel hématopoïétique spécifique PU.1 dans une région peu supprimé. Désormais, nous présentons une fréquence élevée (> 65%) de la mutation faux-sens au niveau du codon 235 dans le domaine de liaison à l'ADN des Ets PU.1 dans murin anti-blanchiment. Des études antérieures, en dehors du contexte de malignité, a déterminé que la conversion de l'arginine 235 (R235) à tout autre résidu d'aminoacide conduit à l'ablation de liaison à l'ADN et la perte de fonction de l'expression de cibles en aval. Nous montrons que la mutation de R235 ne conduit pas à la perte de protéines, et se produit en particulier dans les AML montrant la perte d'une copie de PU.1 (P = 0,001, test exact de Fisher). PU.1 mutations n'ont pas été trouvés dans la région codante, UTR ou un promoteur de l'homme liés à la thérapie AML. Éléments potentiellement réglementaires en amont de PU.1 ont été localisés, mais aucune mutation trouvée. En conclusion, nous avons identifié la cause de la murine radio-induite et AML ont montré que la perte d'une copie de PU.1, comme une conséquence de la transmission indirecte sensibles aux radiations domaines fragiles sur le chromosome 2, et après la conversion R235 sont très spécifiques à cette modèle de souris. Un tel mécanisme ne fonctionne pas, ou est extrêmement rare, chez l'homme AML.
Expression De BNIP3 Dans Le Cancer Du Sein Invasif: Corrélations Avec La Réponse Hypoxique Et Caractéristiques Clinicopathologiques
Bcl-2/adenovirus E1B 19 kDa-interacting protein 3 (BNIP3) est un membre pro-apoptotique de la famille Bcl-2 induite sous hypoxie. Expression faible ou absente a été récemment décrit dans les tumeurs humaines, y compris les tumeurs gastro-intestinales, ce qui entraîne de mauvais pronostic. On connaît peu l'expression BNIP3 dans le cancer du sein invasif. Le but de la présente étude était d'étudier l'expression de BNIP3 dans le cancer du sein invasif à l'ARNm et des protéines en corrélation avec la réponse hypoxique et les caractéristiques clinico-pathologiques.
VEGF Et Les Inhibiteurs De Kinase De Récepteur TGFbeta Type I En Synergie Promouvoir Des Vaisseaux Sanguins Formation En Induisant Alpha5-intégrine Expression
Facteur de croissance vasculaire endothéliale (VEGF) et de facteur de croissance transformant bêta (TGFbeta) sont de puissants régulateurs de l'angiogenèse. Comment le VEGF et le TGFbeta voies de signalisation diaphonie n'est pas bien comprise. Par conséquent, nous avons analysé les effets des TGFbeta de type-I-récepteurs inhibiteurs (SB-431542 et LY-2157299) et du VEGF sur les cellules endothéliales (CE) la fonction et l'angiogenèse. Nous montrons que le SB-431542 améliore considérablement induite par le VEGF formation de plaques de la CE en provenance métatarsiens souris fœtales. Doses sous-optimales de VEGF et le SB-431542 en synergie induite migration CE et la germination des sphéroïdes CE, tandis que la surexpression d'une forme constitutivement active de TGFbeta de type I récepteur a eu des effets opposés. Utilisation de la PCR quantitative, nous avons démontré que le VEGF et le SB-431542 en synergie régulés à la hausse l'expression des ARNm des gènes impliqués dans l'angiogenèse, y compris les intégrines alpha5 et beta3. Régulation à la baisse spécifique de l'intégrine-alpha5 expression ou blocage fonctionnel de alpha5 intégrine avec un anticorps neutralisant inhibe l'effet coopératif des VEGF et le SB-431542 sur CE germination. In vivo, LY-2157299 angiogenèse induite par le VEGF et le renforcement et base-des fibroblastes-facteur de croissance induite par l'angiogenèse dans un essai de Matrigel-plug, alors que l'ajout d'un anticorps alpha5-intégrine-neutralisation de la Matrigel inhiber sélectivement cette réponse accrue. Ainsi, l'induction de l'expression de l'intégrine-alpha5 est un déterminant clé par lequel les inhibiteurs de TGFbeta de type I kinase du récepteur du VEGF et de synergie favoriser l'angiogenèse.
Fas-associated Factor 1 Antagonise Signalisation Wnt Par La Promotion De β-caténine Dégradation
La voie canonique Wnt joue un rôle important dans la régulation de la prolifération et la différenciation cellulaire. L'activation de cette voie de signalisation provoque des perturbations des polypose axine / adénomateuse ou complexes kinase glycogène synthase 3β, entraînant ainsi une stabilisation de la β-caténine et son association avec enhancer facteur lymphoïde / T-cell facteur dans le noyau. Ici, nous identifions Fas-associated factor 1 (FAF1) comme un régulateur négatif de la signalisation Wnt / β-caténine. Nous avons trouvé une surexpression de FAF1 pour inhiber fortement Wnt induite par l'activité du rapporteur de la transcription et de lutter contre Wnt-β-caténine induit l'accumulation. En outre, démontable de FAF1 conduit à une augmentation dans β-caténine et de l'activation de la transcription Wnt / β-caténine-induite. FAF1 a été trouvé pour interagir avec β-caténine sur l'inhibition du protéasome. L'expression ectopique de FAF1 promu β-caténine la dégradation en améliorant son polyubiquitination. Les études fonctionnelles en C2C12 myoblastes et les cellules KS483 préostéoblastiques a montré que l'épuisement FAF1 déclenché l'activation du Wnt endogènes induits par les gènes et la différenciation des ostéoblastes améliorée, tandis que la surexpression FAF1 eu l'effet contraire. Ces résultats mettent en évidence que FAF1 un nouveau facteur inhibiteur de la voie de signalisation canonique Wnt.
APP Et APLP1 Sont Dégradées Par Autophagie En Réponse à L'inhibition Du Protéasome Dans Les Cellules Neuronales
Bêta-amyloïde (Aß) précurseur de la protéine (APP) est une protéine clé dans la pathogenèse de la maladie d'Alzheimer (AD). Les deux APP et son APLP1 paralogue (bêta-amyloïde précurseur-like protein 1) ont de multiples fonctions dans l'adhésion cellulaire et la prolifération. Auparavant, on pensait que l'autophagie est un roman peptide bêta-amyloïde (Aß) générant voie activé dans la MA. Toutefois, la protéolyse des protéines de APLP1 est encore largement inconnu. La présente étude montre que APLP1 est rapidement dégradée dans les cellules neuronales en réponse à des contraintes, telles que l'inhibition du protéasome. Activation du réticulum (ER) le stress endoplasmique par les inhibiteurs du protéasome induit l'autophagie, provoquant une baisse de APLP1/APP mature. Blocage kinase de stress autophagie ou JNK sauve l'expression des protéines à la fois pour l'APP et APLP1. Par conséquent, nos résultats suggèrent que APP/APLP1 est dégradée par l'autophagie et la protéolyse APLP1 est principalement médiée par autophagie lysosome voie.
L'inactivation GSK3 Induit L'apoptose Des Cellules Leucémiques En Réprimant La Fonction De C-myb
Glycogène synthase kinase 3β (GSK3) réglemente divers processus physiologiques, y compris le métabolisme, le développement, l'oncogenèse, et la neuroprotection. Activité de la kinase GSK3 a été signalé à être critique pour les différents types de cellules cancéreuses, mais le mécanisme est resté inaccessible. Dans cette étude, nous examinons le mécanisme par lequel la GSK3 régule la survie des cellules leucémiques. Nous démontrons que sur inhibition de la kinase GSK3 différents types de cellules leucémiques présentent des défauts graves de prolifération en tant que résultat de l'apoptose. Le facteur de transcription c-Myb se trouve à être la cible principale de l'inhibition de la GSK3 dans la survie cellulaire. Inactivation GSK3 réduit l'expression de c-Myb par la promotion de son ubiquitination médiée par la dégradation, ce qui inhibe l'expression de c-Myb-dépendante anti-apoptotique Bcl2 gènes et la survivine. Co-immunoprécipitation, dosages reporteurs, immunoprécipitation chromatine, et les études knockdown montrent que c-Myb a besoin d'interagir et de coopérer avec le facteur de transcription LEF-1 dans l'activation de Bcl2 et survivine et que les deux facteurs de transcription sont nécessaires pour la survie cellulaire. Ces données révèlent un mécanisme non encore inconnue par laquelle la GSK3 contrôle la survie des cellules.
Voie De Signalisation Wnt / β-caténine Stabilise Domaine D'application Intracellulaire (AICD) Et La Promotion De Son Activité Transcriptionnelle
Précurseur de la protéine amyloïde (APP), une protéine clé dans la pathogenèse de la maladie d'Alzheimer (AD), est une protéine transmembranaire de type I, qui peut être clivée par β-et γ-sécrétase pour libérer les amyloïdogéniques β-amyloïdes peptides (Aß) et l'APP domaine intracellulaire (AICD). Alors que Aß a été largement considérée provoquent des cascades pathogènes aboutissant AD, les fonctions physiologiques et les règlements de l'AICD demeurent insaisissables. Dans la présente étude, l'AICD endogène a été démontré être augmenté par le signal Wnt canonique. Au lieu de raison de γ-sécrétase activité, renforcée expression AICD a été trouvé en raison de la stabilité accrue des protéines par voie Wnt / β-caténine. β-caténine a été démontré être un partenaire de l'association AICD, capable de promouvoir l'AICD activité transcriptionnelle médiée. Enquête menée par l'AICD mutants prouvé que Fe65, un partenaire déjà identifié AICD contraignant, n'est pas impliqué dans ce règlement. Pris dans leur ensemble, nos résultats suggèrent que l'AICD est stabilisé et l'AICD activité transcriptionnelle médiée est favorisée par canonique Wnt / β-caténine indépendante de Fe65 signalisation.
BMP-7 TGF-β Inhibe Induite Par L'invasion Des Cellules Du Cancer Du Sein Par Inhibition De La β Intégrine (3) Expression
Le facteur de croissance transformant bêta (TGF)-β superfamille comprend cytokines telles que les protéines morphogénétiques de TGF-ß et Bone (PGB), qui jouent un rôle critique dans une multitude de processus biologiques. Dans le cancer du sein, des niveaux élevés de TGF-β sont associés à un mauvais pronostic, alors que l'inhibition de la β-TGF-signalisation réduit les métastases. En revanche, la BMP-7 inhibe la métastase osseuse des cellules de cancer du sein.
