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Articles by Theodore Davis in JoVE
JoVE Neuroscience
Haute Sensibilité 5-hydroxyméthylcytosine détection dans le tissu cérébral des souris Balb / C
Applications and Product Development, New England Biolabs
Le EpiMark 5-HMC et le kit d'analyse 5-MC peut être utilisé pour analyser et quantifier 5-méthylcytosine et 5-hydroxyméthylcytosine au sein d'un locus de SPE spécifiques. Le kit distingue 5-MC à partir de 5-HMC par l'ajout de glucose pour le groupe hydroxyle de 5-HMC via une réaction enzymatique utilisant β-glucosyltransférase (T4-TBG). Lorsque 5-HMC survient dans le contexte de la CCBG, cette modification convertit un site clivable Mspl à un site non clivable.
Other articles by Theodore Davis on PubMed
Isolation Efficace Des Cibles Caenorhabditis Elegans Souches De Suppression à L'aide D'endonucléases De Restriction Très Thermostables Et PCR
Des approches de génétiques inverses pour comprendre la fonction des gènes seraient grandement facilitées en augmentant l'efficacité des méthodes pour isoler des mutants sans le recours à un phénotype prédit. Méthodes établies par PCR d'isoler des mutants de délétion sont largement utilisés à cet effet dans des elegans de Caenorhabditis. Cependant, ces méthodes sont inefficaces à isoler les petites délétions. Nous rapportons ici une nouvelle modification du PCR-based methods, utilisant des enzymes de restriction thermostables de bloquer la synthèse du produit PCR de type sauvage, afin que seul le produit PCR de suppression est amplifié. Cette modification augmente considérablement l'efficacité d'isolement de petites délétions ciblées de C.elegans. À l'aide de cette méthode six nouvelles suppression souches ont été isolées d'un petit écran d'environ 400 000 de génomes haploïdes, plus de destructions < 1,0 kb. Environ 10 fois plus grand regroupement d'échantillons d'ADN, réduire l'effort et les réactifs nécessaires pour les écrans a permis une plus grande sensibilité de détection par PCR de cette modification. En outre, efficace contre d'amplification non spécifiques autorisés multiplexage avec plusieurs paires d'amorces indépendant. L'efficacité accrue de cette technique rend plus pratiques pour les petits laboratoires d'entreprendre des écrans de knock-out de gène.
MmeI : Un Type II-modification Des Restrictions Système Minimal Qui Modifie Uniquement Un Seul Brin D'ADN Pour La Protection De L'hôte
MmeI est une enzyme de restriction de Type II inhabituelle qui est utile pour générer des étiquettes de longues séquences. Nous avons cloné le système de restriction-R-M (modification) MmeI et trouvé se composer d'une seule protéine endonucléase et activités d'ADN méthyltransférase. La protéine comprend un domaine amino-terminale endonucléase et un central domaine l'ADN méthyltransférase, domaine de reconnaissance ADN C-terminal. L'endonucléase coupe les deux brins d'ADN au même endroit en même temps, avec l'enzyme liée à deux sites interagissant pour accomplir la scission. Le clivage se produit plus rapidement que le transfert de méthyle sur l'ADN non modifié. MmeI modifie seulement l'adénine dans le volet supérieur, 5'-TCCRAC-3'. Activité endonucléasique MmeI est bloquée par cette méthylation d'adénine de brin supérieur et n'est pas affectée par la méthylation de l'adénine dans le brin complémentaire, 5'-GTYGGA-3'. Il n'y a aucune modification de l'ADN supplémentaire associée au système de la MmeI R-M, comme est requise pour les systèmes de Type IIG R-M précédemment caractérisées. Ainsi, le système MmeI R-M utilise modification sur une seule des deux brins de l'ADN pour la protection de l'hôte. L'architecture de la MmeI représente une approche minimale au montage d'un système de restriction-modification dans laquelle un seul domaine de la reconnaissance de l'ADN cible l'endonucléase et activités d'ADN méthyltransférase.
La Famille MspJI Des Endonucléases De Restriction De Modification Dépendant D'études épigénétiques
MspJI est une endonucléase de restriction de modification dépendant roman qui s'attache à une distance fixe du site de la modification. Nous présentons ici la caractérisation biochimique de plusieurs MspJI homologues, y compris FspEI, LpnPI, AspBHI, RlaI et SgrTI. Toutes les enzymes spécifiquement reconnaissent modification C5 de cytosine (méthylation ou hydroxymethylation) dans l'ADN et s'attacher à une distance constante (N(12)/N(16)) loin de la cytosine modifiée. Chacun affiche sa propre préférence de contexte séquence, favorisant les différents nucléotides flanquant la cytosine modifiée. Par clivage des deux côtés des sites de CpG entièrement modifiés, ils permettent l'extraction de fragments longs 32-base autour des sites mis à jour le de l'ADN génomique. Ces enzymes fournissent des outils puissants pour l'interrogation directe de l'épigénome. Par exemple, nous montrons que RlaI, une enzyme qui préfère (m) GTC mais pas les sites de CpG (m), génère des patrons de digestion qui diffèrent entre la plante et l'ADN génomique chez les mammifères, en soulignant la différence entre leurs patrons épigénomique. En outre, nous démontrons que profond de séquençage de fragments d'ADN digérés produit de ces enzymes fournit une méthode possible pour cartographier les sites mis à jour le dans le génome. Au total, la famille MspJI d'enzymes représente des outils attrayants de choix pour le développement de méthode en études épigénétiques de l'ADN.
