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Articles by Theodore Davis in JoVE
JoVE Neuroscience
High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine rilevamento in Balb / C tessuto cerebrale
Applications and Product Development, New England Biolabs
Il EpiMark 5-HMC e 5-mC Kit analisi può essere utilizzato per analizzare e quantificare 5-metilcitosina e 5-hydroxymethylcytosine all'interno di un luogo spe specifico. Il kit distingue 5-5-mC da HMC con l'aggiunta di glucosio al gruppo ossidrilico di 5-HMC tramite una reazione enzimatica che utilizza β-glucosiltransferasi (T4-BGT). Quando 5-HMC si verifica nel contesto di CCGG, questa modifica converte un sito cleavable MspI a un non-cleavable sito.
Other articles by Theodore Davis on PubMed
Efficiente Isolamento Mirato Caenorhabditis Elegans Ceppi Eliminazione Tramite Endonucleasi Altamente Termostabile E PCR
Approcci di genetici inverso per comprendere la funzione del gene sarebbero facilitati notevolmente aumentando l'efficienza dei metodi per isolare mutanti senza la dipendenza da un fenotipo previsto. Metodi basati sulla PCR consolidati di isolamento di mutanti di delezione sono ampiamente utilizzati per questo scopo in Caenorhabditis elegans. Tuttavia, questi metodi sono inefficienti ad isolare piccole delezioni. Riportiamo qui una romanzo modifica dei metodi basati sulla PCR, che impiegano enzimi di restrizione termostabili per bloccare la sintesi del prodotto di PCR del selvaggio-tipo, così che solo il prodotto di PCR di eliminazione è amplificato. Questa modifica aumenta notevolmente l'efficienza dell'isolamento di piccole delezioni mirate in c. elegans. Utilizzando questo metodo sei nuovi eliminazione ceppi sono stati isolati da un piccolo schermo di circa 400 000 genomi aploidi, più con delezioni < 1.0 kb. Una maggiore sensibilità di rilevamento PCR da questa modifica consentita circa 10 volte maggiore pool di campioni di DNA, riducendo lo sforzo e i reagenti necessari per gli schermi. Inoltre, efficace soppressione di amplificazione non specifico permesso multiplexing con diverse coppie di primer indipendente. L'aumento dell'efficienza di questa tecnica lo rende più pratico per piccoli laboratori di intraprendere gli schermi di gene knock-out.
MmeI: Un Tipo II Restrizione-modificazione Sistema Minimale Che Modifica Solo Un Filo Del DNA Di Protezione Host
MmeI è un insolito enzima di restrizione di tipo II che è utile per generare tag lunga sequenza. Abbiamo clonato il sistema di restrizione-modificazione (R-M) MmeI e trovato che consistono di una singola proteina avendo endonucleasi e attività di DNA metiltransferasi. La proteina è costituito da un dominio amino-terminale endonucleasi, un dominio centrale di methyltransferase del DNA e dominio di riconoscimento del DNA C-terminale. Le endonucleasi taglia simultaneamente, i due filamenti di DNA in un sito con enzima legato a due siti di interazione per compire la scissione. Scissione si verifica più rapidamente di trasferimento del metile sul DNA non modificato. MmeI modifica solo l'adenina nel filo top, 5 '-TCCRAC - 3'. Attività endonucleasi MmeI è bloccato da questa metilazione di adenina filo top e non è influenzato da metilazione dell'adenina in filamento complementare, 5 '-GTYGGA - 3'. Non non c'è nessun ulteriori modifiche del DNA associato al sistema MmeI R-M, come è richiesto per i sistemi di tipo IIG R-M in precedenza caratterizzato. Il sistema MmeI R-M utilizza quindi modifica su uno solo dei due filamenti di DNA di protezione host. L'architettura MmeI rappresenta un minimo approccio al montaggio di un sistema di restrizione-modificazione in cui è destinato un singolo dominio di riconoscimento del DNA endonucleasi sia attività di DNA metiltransferasi.
La Famiglia MspJI Di Endonucleasi Modifica-dipendente Per Studi Epigenetici
MspJI è una romanzo endonucleasi di restrizione modifica-dipendente che fende a una distanza fissa lontano dal sito di modificazione. Qui, vi presentiamo la caratterizzazione biochimica dei diversi omologhi MspJI, compresi FspEI, LpnPI, AspBHI, RlaI e SgrTI. Tutti gli enzimi specificamente riconoscere modifica di citosina C5 (metilazione o hydroxymethylation) in DNA e fendere a distanza costante (N(12)/N(16)) lontano dalla citosina modificato. Ciascuno consente di visualizzare la propria preferenza contesto di sequenza, favorendo diversi nucleotidi fiancheggianti la citosina modificato. Da fendendo su entrambi i lati dei siti CpG completamente modificati, permettono l'estrazione dei frammenti lunghi 32-base intorno ai siti modificati da DNA genomic. Questi enzimi forniscono potenti strumenti per l'interrogazione diretta dell'Epigenoma. Per esempio, mostriamo che RlaI, un enzima che preferisce (m) CWG ma non luoghi di CpG (m), genera schemi di digestione che differiscono tra pianta e DNA genomic mammifero, evidenziando la differenza tra i modelli di epigenomic. Inoltre, dimostriamo che deep sequencing dei frammenti del DNA digeriti generati da questi enzimi fornisce un metodo fattibile per mappare i siti modificati nel genoma. Complessivamente, la famiglia MspJI di enzimi rappresenta interessanti strumenti di scelta per lo sviluppo del metodo negli studi di epigenetici del DNA.
