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Articles by Timothy Block in JoVE
JoVE General
Chemisch-Antikörper blockiert Microarray für Multiplex-High-Throughput-Profiling von spezifischen Protein-Glykosylierung bei Complex Samples
1Institute for Hepatitis and Virus Research, 2Department of Microbiology and Immunology, Thomas Jefferson University, 3Drexel University College of Medicine, 4Van Andel Research Institute, 5Institute for Hepatitis and Virus Research, Serome Biosciences Inc.
In dieser Studie beschreiben wir ein verbessertes Protokoll für eine Multiplex-Hochdurchsatz-Antikörper Mikroarray mit Lektin Detektionsverfahren, das in der Glykosylierung Profilierung spezifischer Proteine verwendet werden können. Dieses Protokoll bietet zuverlässige neue Reagenzien und reduziert den Zeitaufwand, Kosten und Laborgeräte Anforderungen an das vorherige Verfahren verglichen.
Other articles by Timothy Block on PubMed
Eine Verschlossene Nukleinsäure-Klemme-vermittelte PCR Assay Für P53 Codon 249 Hotspot Mutation Im Urin
Hepatozelluläres Karzinom (HCC) hat eine 5-Jahres-Überlebensrate von < 10 % weil es schwierig ist zu früh zu diagnostizieren. Mutationen des TP53-Gens sind etwa 50 % der menschlichen Krebserkrankungen zugeordnet. Eine Hotspot-Mutation, eine G:C zu T:A Transversion an Codon 249 (249T), möglicherweise einen möglichen DNA-Marker für HCC-Screening wegen seine exklusive Präsenz im HCC und seine Entdeckung in der Zirkulation von einigen Patienten mit HCC. Eine verschlossene Nukleinsäure-Klemme-vermittelte PCR Assay, gefolgt von Schmelzen Kurvenanalyse (mit der SimpleProbe), wurde entwickelt, um die Mutation des TP53-249T zu erkennen. In dieser Probe die verschlossene Nukleinsäure-Klemme unterdrückt Haushaltsjahre ab Kopien von Wildtyp Vorlagen und Erkennung der 249T mutiert-Vorlage, mit einer Empfindlichkeit von 0,1 % (1) der Mutant/Wildtyp-Ratio, beurteilt durch einen rekonstituierten Standard innerhalb von 2 Stunden gestattet. Mit einer Größe von Amplikons 41 bp, es erkennt Ziel DNA-Sequenzen in kurzen fragmentierten DNA-Templates. Die gefundenen Mutationen wurden durch Analyse der DNA-Sequenzierung überprüft. Wir haben dann DNA isoliert von Urinproben von Patienten mit HCC für p53-Mutationen und identifizierte positive TP53-Mutationen in 9 von 17 Proben getestet. Die Möglichkeit der Verwendung dieses neuartige TP53 249T Assay Entwicklung ein Urin oder Bluttest für HCC-Screening wird diskutiert.
Methylierung Der CpG-Websites Nur Der Sinn-Strang Des APC-Gens Ist Spezifisch Für Das Hepatozelluläre Karzinom
Hypermethylierung des Promotors der Tumor-Suppressor-Gens, adenomatösen Polyposis coli (APC), tritt in verschiedenen bösartigen Tumoren, wie Hepatozelluläres Karzinom (HCC). Jedoch haben die Berichte über die Besonderheit von der Methylierung des APC-Gens für HCC variiert. Um einen Einblick in diese Variationen wie auftreten, Bisulfit-PCR-Sequenzierung wurde durchgeführt, um die Methylierungstest Sinn und "Antisense" Stränge des APC-Gens in Proben von HCC Gewebe analysieren, abgestimmt angrenzende nicht-HCC Lebergewebe, Hepatitis, Leberzirrhose und normalen Leber Geweben. DNA aus fetalen Leber und 12 nonhepatic normalem Gewebe wurde auch geprüft. Diese Experimente offenbart Leber-spezifische, antisense Strang-voreingenommen CpG Methylierung des APC-Gens und vorgeschlagen, obwohl Methylierung des Teilprogramms antisense des APC-Gens in normale Leber und andere nicht-HCC-Krankheit, Leber-Gewebe vorhanden ist, vorwiegend Methylierung des Teilprogramms Sinn des APC-Gens im HCC auftritt. Um die Wirkung von der DNA-Strang auf die Besonderheit der methylierte APC-Gen als Biomarker für HCC-Erkennung zu bestimmen, quantitative Methylierungs-spezifische PCR-Assays für Sense und antisense Strang DNA entwickelt und auf DNA isoliert von HCC durchgeführt wurden (n = 58), abgestimmt angrenzende nicht-HCC (n = 58), Leberzirrhose (n = 41), und Hepatitis (n = 39). Empfänger Betrieb Kennlinien wurden gebaut. Mit dem cutoff Wert an der Nachweisgrenze, die Besonderheit der Sense und antisense Strang Methylierung betrug 84 % bzw. 43 %, und Empfindlichkeit betrug 67,2 % bzw. 72,4 %. Dieses Ergebnis zeigte, dass die Identität der methylierte DNA-Strang die Spezifität von APC HCC-Erkennung beeinflusst. Interessanterweise kam Methylierung des Teilprogramms Sinn von APC in 40 % der HCCs von Patienten mit Serum AFP weniger als 20 ng/mL, Ebenen, was auf eine mögliche Rolle für APC als Biomarker, AFP im HCC-Screening zu ergänzen.
Erkennung Von Hypermethylated Vimentin Im Urin Von Patienten Mit Dickdarmkrebs
Wir zuvor nachweislich Urin Low-molecular-Weight (LMW) enthält (< 300 bp), Kreislauf-abgeleitet von DNA, die verwendet werden kann, um Krebs-spezifische Mutationen zu erkennen, wenn ein Tumor vorhanden ist. Ziel dieser Studie war es, ein Assay zur Erkennung der Dickdarmkrebs (CRC) entwickeln-assoziierten, Zirkulation abgeleiteten, epigenetische DNA Hypermethylated Vimentin Markergen (mVIM) im Urin von Patienten mit Dickdarmkrebs. Eine künstliche 18-Nukleotid-DNA-Sequenz wurde hat, am 5' Ende der Zündkapseln des ersten PCR Zyklus um den Amplikons vergrößern, die dann in die Zündkapseln des zweiten PCR Zyklus integriert wurde. Eine quantitative MethyLight PCR-basierten Assay für eine 39-Nukleotid-Vorlage wurde entwickelt und verwendet mVIM im CRC Gewebe zu quantifizieren und Urinproben. mVIM in 75 % der LMW-Urin-DNA-Proben von Patienten mit Dickdarmkrebs erkannt wurde (n = 20) und in 10 % der Urinproben von Kontrollpersonen mit keinen bekannten Neoplasie (n = 20); 12 von 17 LMW DNA Urinproben (71 %) aber nur 2 von 17 High-molecular-Weight DNA Urinproben (12 %) von Patienten mit nachweisbaren mVIM mVIM-positiven Gewebe enthalten, die darauf hindeutet, dass die mVIM erkannt im LMW Urin DNA aus dem Blutkreislauf abgeleitet ist. Die Erkennung von mVIM im Urin war deutlich in Zusammenhang mit CRC verglichen mit Steuerelementen (P < 0,0001, von Fishers exakter Test). Ein potenzielle Urin-Test für die CRC-Prüfung mit epigenetische Markern wird diskutiert.
Auswirkungen Des Standortes Der CpG Methylierung Innerhalb Des GSTP1-Gens Auf Seiner Besonderheit Als DNA Marker Für Das Hepatozelluläre Karzinom
Hypermethylierung von der Glutathion-S-Transferase π 1 (GSTP1) Gen-Promotor-Region wurde berichtet potenzielle Biomarker Hepatozelluläres Karzinom (HCC) von anderen Lebererkrankungen zu unterscheiden sein. Jedoch haben Berichte über wie spezifische Marker ist es reichte von 100 % auf 0 %. Wir die Hypothese, dass weitgehend, die Variation der Besonderheit der Lage der untersuchten Websites CpG abhängt. Um diese Hypothese zu testen, verglichen wir die Methylierungstest der GSTP1 Projektträger Region der DNA isoliert von HCC, Leberzirrhose, Hepatitis und normalen Leber Geweben von Bisulfit-PCR-Sequenzierung. Wir fanden, dass die 5'-Region der Position-48 nt von der Transkription-Start-Website von der GSTP1 gen im HCC, selektiv methyliert ist, während die 3'-Region in allen Geweben der Leber methyliert ist, einschließlich der normalen Leber und das HCC-Gewebe untersucht. Interessanterweise als DNA aus fetalen Leber und 11 nonhepatic normalem Gewebe auch von Bisulfit-PCR-Sequenzierung untersucht wurde, fanden wir die Methylierung von 3' Region der Projektträger Leber-spezifischen zu sein schien. Eine Ausrichtung der 5'-Region des Projektträgers Methylierungs-spezifische PCR-Assay entwickelt und verwendet, das methylierte GSTP1 gen in verschiedenen kranke Leber Gewebe, einschließlich HCC zu quantifizieren. Wenn wir eine Probe, die Ausrichtung der 3'-Region verwendet, wir fanden, dass die Methylierung von 5'-Ende des Projektträgers GSTP1 wesentlich spezifischer als der 3'-Ende (97,1 % vs. 60 %, p < 0,0001 von Fishers exakter Test) für die Unterscheidung von HCC (n = 120) von Hepatitis (n = 35) und Leberzirrhose (n = 35). Es ist ermutigend, enthaltenen 33,8 % der AFP-negativ-HCC methylierte GSTP1 gen. Diese Studie zeigt deutlich die Bedeutung der Lage der CpG Website Methylierung für HCC-Spezifität und wie Leber-spezifischen DNA-Methylierung gelten sollte als ein epigenetischer DNA-Marker für die Erkennung von HCC studierte ist.
