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Articles by Timothy Block in JoVE
JoVE General
Anticorpo Microarray chimicamente bloccato per Multiplexed high-throughput Profiling di glicosilazione delle proteine specifico in campioni complessi
1Institute for Hepatitis and Virus Research, 2Department of Microbiology and Immunology, Thomas Jefferson University, 3Drexel University College of Medicine, 4Van Andel Research Institute, 5Institute for Hepatitis and Virus Research, Serome Biosciences Inc.
In questo studio, si descrive un protocollo migliorato per un multiplato ad alta resa microarray anticorpo con metodo di rilevazione lectina che può essere utilizzato in profili glicosilazione di proteine specifiche. Questo protocollo offre nuovi reagenti affidabili e riduce sensibilmente i tempi, i costi e alle attrezzature di laboratorio rispetto alla procedura precedente.
Other articles by Timothy Block on PubMed
Un Acido Nucleico Locked Morsetto-mediato PCR Test Per L'individuazione Di Una Mutazione Di P53 Codone 249 Hotspot Nelle Urine
Carcinoma epatocellulare (HCC) ha un tasso di sopravvivenza a 5 anni di < 10% perché è difficile da diagnosticare precocemente. Le mutazioni del gene TP53 sono associate circa il 50% dei tumori umani. Una mutazione di hotspot, un g a transversion g:c nel codone 249 (249T), può essere un potenziale marker di DNA per lo screening di HCC a causa della sua presenza esclusiva in HCC e sua individuazione nella circolazione di alcuni pazienti con HCC. Un acido nucleico locked morsetto-mediato PCR assay, seguita dalla fusione analisi della curva (usando il SimpleProbe), è stato sviluppato per rilevare la mutazione di TP53 249T. In questo saggio, il morsetto dell'acido nucleico locked soppresso 10 copie di modelli wild-type e consentito il rilevamento del modello 249T-mutato, con una sensibilità di 0,1% (1:1000) del rapporto mutante/wild-type, valutato da uno standard ricostituito entro 2 ore. Con una dimensione di ampliconi di 41 bp, rileva target DNA sequences in breve frammentati modelli del DNA. Le mutazioni rilevate sono state convalidate da analisi di sequenziamento del DNA. Abbiamo quindi testato DNA isolato da campioni di urine di pazienti con HCC per mutazioni p53 e identificate mutazioni TP53 positive in 9 dei 17 campioni. È discussa la possibilità di utilizzo di questo romanzo TP53 249T dosaggio per sviluppare un test del sangue per lo screening di HCC o delle urine.
La Metilazione Dei Siti CpG Solo Sul Filamento Senso Del Gene APC è Specifica Per Il Carcinoma Epatocellulare
Ipermetilazione del promotore del gene soppressore tumorale, coli poliposi adenomatosa familiare (APC), si verifica in diversi tumori maligni, tra cui il carcinoma epatocellulare (HCC). Tuttavia, rapporti sulle specificità della metilazione del gene APC per HCC hanno variato. Per ottenere l'intuizione come queste variazioni si verificano, sequenziamento PCR del bisolfuro è stata eseguita per analizzare lo stato di metilazione dei fili sia senso e antisenso del gene APC in campioni di tessuto HCC, abbinati adiacenti non-HCC tessuto epatico, epatite, cirrosi e tessuti epatici normali. DNA derivato dal fegato fetale e 12 nonhepatic tessuto normale è stato anche esaminato. Questi esperimenti hanno rivelato specifico del fegato, antisense strand-biased CpG metilazione del gene APC e ha suggerito che, anche se nel fegato normale e altri tessuti di malattia epatica HCC non esiste metilazione del filamento antisenso del gene APC, la metilazione del filamento senso del gene APC avviene prevalentemente in HCC. Per determinare l'effetto del filo del DNA sulla specificità del gene APC metilato come un biomarker per l'individuazione di HCC, quantitative saggi PCR metilazione-specifico per senso e antisense strand DNA sono stati sviluppati ed eseguite sul DNA isolato da HCC (n = 58), abbinati adiacenti non-HCC (n = 58), cirrosi (n = 41) e l'epatite (n = 39). Ricevitore curve caratteristiche di funzionamento sono stati costruiti. Con il valore massimo impostato il limite di rilevazione, la specificità del senso e antisense strand metilazione era 84% e 43%, rispettivamente, e sensibilità era 67.2% e 72,4%, rispettivamente. Questo risultato ha dimostrato che l'identità del filo del DNA metilato influenzato la specificità dell'APC per il rilevamento di HCC. È interessante notare, metilazione del filamento senso di APC avvenuta nel 40% dei HCCs da pazienti con siero che AFP livelli inferiore a 20 ng/mL, suggerendo un ruolo potenziale per APC come un biomarker per integrare AFP nello screening di HCC.
Rilevamento Della Vimentina Hypermethylated Nelle Urine Di Pazienti Con Cancro Del Colon-retto
Abbiamo dimostrato in precedenza che l'urina contiene basso peso molecolare (LMW) (< 300 bp), derivato da circolazione del DNA che può essere utilizzato per rilevare il cancro-specifiche mutazioni se un tumore è presente. L'obiettivo di questo studio era quello di sviluppare un test per rilevare il cancro del colon-retto (CRC)-associato, derivato da circolazione, epigenetica del DNA hypermethylated vimentina gene marcatore (mVIM) nelle urine di pazienti con CRC. Una sequenza di DNA 18-nucleotide artificiale è stato aggiunto all'estremità 5' degli iniettori del primo ciclo PCR per aumentare la dimensione di amplicon, che è stato poi integrata negli iniettori del secondo ciclo PCR. Un dosaggio quantitativo MethyLight PCR-based targeting un modello 39-nucleotide è stato sviluppato e utilizzato per quantificare mVIM nei tessuti CRC e abbinato i campioni di urina. mVIM è stato rilevato nel 75% dei campioni di DNA di urina LMW da pazienti con CRC (n = 20) e nel 10% dei campioni di urina di soggetti di controllo con nessuna neoplasia noto (n = 20); 12 di 17 LMW DNA campioni di urina (71%) ma solo 2 dei 17 campioni di DNA ad elevato peso molecolare urina (12%) nei pazienti con tessuti mVIM-positivi contenuti mVIM rilevabili, suggerendo che il mVIM rilevato nell'urina LMW DNA è derivato dalla circolazione. La rilevazione di mVIM nelle urine era significativamente associata con CRC rispetto ai controlli (P < 0.0001, dai test esatto di Fisher). Un potenziale test delle urine per lo screening del CRC utilizzando marcatori epigenetici è discusso.
Impatto Della Posizione Di CpG Metilazione Del Gene GSTP1 Sulla Sua Specificità Come Un Marcatore Di DNA Per Carcinoma Epatocellulare
Hypermethylation della glutatione S-trasferasi π 1 (GSTP1) regione promotore gene è stato segnalato per essere un potenziale biomarcatore per distinguere il carcinoma epatocellulare (HCC) da altre malattie del fegato. Tuttavia, segnalazioni relative a specifico come un marcatore che è hanno spaziato dal 100% allo 0%. Abbiamo ipotizzato che, in larga misura, la variazione della specificità dipende dalla posizione dei siti CpG analizzate. Per verificare questa ipotesi, abbiamo confrontato lo stato di metilazione della regione del promotore GSTP1 del DNA isolato da HCC, cirrosi, epatite e tessuti epatici normali mediante sequenziamento del bisolfuro-PCR. Abbiamo trovato che la regione 5' della posizione -48 nt dal sito di inizio trascrizione di GSTP1 gene è metilato selettivamente in HCC, considerando che la regione 3' è metilata in tutti i tessuti epatici esaminati, compresi fegato normale e il tessuto HCC. È interessante notare che, quando il DNA derivato dal fegato fetale e 11 nonhepatic tessuto normale è stato anche esaminato dal sequenziamento del bisolfuro-PCR, abbiamo trovato che la metilazione di 3' regione del promotore sembrava essere specifici del fegato. Un dosaggio PCR metilazione-specifico della regione 5' del promotore di targeting è stato sviluppato e utilizzato per quantificare il gene GSTP1 metilato in vari tessuti malati fegati tra cui HCC. Quando abbiamo usato un dosaggio di targeting per la regione 3', abbiamo trovato che la metilazione di 5'--fine del promotore GSTP1 era significativamente più specifica rispetto a quella di 3' fine (97.1% vs 60%, p < 0.0001 da test esatto di Fisher) per distinguere HCC (n = 120) da epatite (n = 35) e cirrosi (n = 35). Incoraggiante, 33,8% di HCC AFP negativi contenuti del gene GSTP1 metilato. Questo studio dimostra chiaramente l'importanza della posizione di CpG metilazione del sito per specificità HCC e metilazione del DNA come fegato specifici dovrebbero essere considerati quando un DNA marker epigenetici è studiato per la rilevazione di HCC.
