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Articles by Timothy Block in JoVE
JoVE General
複雑なサンプル中の特定のタンパク質のグリコシル化の多重化ハイスループットプロファイリングのための化学的にブロックされた抗体マイクロアレイ
1Institute for Hepatitis and Virus Research, 2Department of Microbiology and Immunology, Thomas Jefferson University, 3Drexel University College of Medicine, 4Van Andel Research Institute, 5Institute for Hepatitis and Virus Research, Serome Biosciences Inc.
本研究では、特定のタンパク質のグリコシル化プロファイリングに使用することができるレクチン検出法による多重化、ハイスループット抗体マイクロアレイのための改良プロトコルを記述します。このプロトコルは、新しい信頼性の高い試薬を備えており、前の手順に比べて大幅に時間、コスト、およびラボ機器の要件を軽減します。
Other articles by Timothy Block on PubMed
ロックされた核酸クランプを介した PCR アッセイ尿中の P53 のコドン 249 ホット スポット変異の検出。
肝細胞癌 (HCC) の 5 年生存率いる < 10% 早期診断が困難なため。TP53 遺伝子の変異は、人間のがんの約 50 ％ に関連付けられています。ホット スポットの突然変異 T:A 有無コドン 249 (249T) に G:C 肝細胞癌スクリーニングの潜在的な DNA マーカー HCC での独占的なプレゼンスとその検出症例のいくつかの循環のためかもしれない。融解曲線解析、(、SimpleProbe を使用) によって続いて、ロックされた核酸クランプを介した PCR アッセイ、TP53 249T 突然変異を検出するために開発されました。このアッセイ ロックされた核酸クランプ 10 (7) 野生型テンプレートのコピーを抑制し、再構成した標準で 2 時間以内の査定、変異/野生型比 0.1% (1000) の感度とテンプレート、249T 変異の検出を許可しました。増幅バンド長サイズ 41 である bp は、検出ターゲット DNA シーケンス要するに断片化された DNA テンプレート。検出された変異は DNA シーケンス解析によって検証されました。我々 はそれから p53 遺伝子変異と識別された正 TP53 の突然変異 9 17 サンプルの肝細胞癌患者の尿サンプルから分離された DNA をテストしました。この小説の TP53 249T アッセイを使用して、尿または肝細胞癌のスクリーニングのための血液検査を開発する可能性を説明します。
メチル化 CpG サイト APC 遺伝子のセンス鎖上でのみの肝細胞癌に対して固有です。
腫瘍のサプレッサー遺伝子大腸菌大腸腺腫症 (APC) のプロモーターのメチル化肝細胞癌 (HCC) を含む様々 な悪性腫瘍で発生します。ただし、肝細胞癌に対する APC 遺伝子のメチル化の特異性に関するレポートを変えた。これらのバリエーションをどのように発生するのに把握するには、重亜硫酸塩 PCR シーケンスのセンスおよびアンチセンス鎖における肝細胞癌組織の標本 APC 遺伝子のメチル化状態分析を行った、隣接する非 HCC 一致した肝組織、肝炎、肝硬変や正常肝組織。DNA は胎児の肝臓から派生し、12 nonhepatic 正常組織も調べた.これらの実験は肝特異、アンチセンス ストランド バイアス CpG のメチル化 APC 遺伝子を明らかにした、アンチセンス鎖 APC 遺伝子のメチル化は正常肝と他非肝疾患肝組織に存在しますが、センス鎖 APC 遺伝子のメチル化が HCC で主に発生することも提案しました。Dna メチル化 APC 遺伝子 HCC 検出のバイオ マーカーとしての特異性の影響を判断するには、定量的なメチル化特定の PCR の試金センスおよびアンチセンス鎖 DNA の開発、HCC から分離された DNA を実行 (n = 58）、隣接する非 HCC の一致 (n = 58）、肝硬変 (n = 41) と肝炎 (n = 39)。受信機の動作特性曲線が建設されました。カットオフの値設定検出限界、センスおよびアンチセンス鎖の特異性でメチル化 84 ％、43 ％、それぞれ、され感度 67.2% と, 72.4% それぞれだった。この結果は APC の特異性肝細胞癌検出のための影響をメチル化された DNA 鎖のアイデンティティを実証しました。興味深いことに、APC のセンス鎖のメチル化 Hcc の 40% から患者血清の AFP 未満 20 Ng/ml レベルの afp 通信における肝癌スクリーニングを補完するバイオ マーカーとして APC の潜在的な役割を示唆発生。
大腸癌患者の尿中 Hypermethylated ビメンチンの検出。
我々 は以前、尿が低分子 (LMW) が含まれている実証 (< 300 bp)、循環由来の腫瘍が存在する場合がん特定の突然変異を検出するために使用することができます DNA。本研究の目的は大腸癌 (CRC) を検出するアッセイを開発することでした-関連付けられて、循環派生、エピジェネティックな DNA マーカー hypermethylated ビメンチン遺伝子 (mVIM) CRC 患者の尿中。人工の 18 ヌクレオチド DNA シーケンスの後 2 番目の PCR のサイクルのプライマーに統合された増幅バンド長サイズを増やすには最初の PCR のサイクルのプライマーの 5' 末端でタグ付けされました。39 ヌクレオチド テンプレートをターゲット定量的 MethyLight PCR ベースのアッセイ開発 mVIM CRC 組織を定量化するために使用し、尿のサンプルを一致します。mVIM は、CRC 患者から LMW 尿 DNA サンプルの 75 ％ で検出された (n = 20) とない既知の腫瘍コントロール被験者の尿サンプルの 10% (n = 20);12 17 LMW 尿 DNA サンプルの (71%) が含まれている mVIM 陽性組織検出 mVIM LMW 尿中 DNA 検出 mVIM 循環から派生していることを示唆して患者からの 17 の高分子量尿 DNA サンプル (12%) の 2 のみ。尿中 mVIM の検出はコントロールに比べて CRC と大幅に関連付けられていた (P < 0.0001、フィッシャーの正確なテストが)。エピジェネティックな遺伝子マーカーを使用する CRC のスクリーニングの潜在的な尿検査を説明します。
その特異性の肝細胞癌の DNA マーカーとして GSTP1 遺伝子内の CpG のメチル化の位置の影響
メチル化グルタチオン s-トランスフェラーゼの π の 1 (GSTP1) 遺伝子プロモーター領域から他の肝疾患の肝細胞癌 (HCC) を区別するために潜在的なバイオ マーカーに報告されています。しかし、報告書のそれですどのように特定のマーカーについて 100 ％ から 0 ％ に及んだ。我々 は、大部分は、特異性の変動分析 CpG のサイトの場所に応じて変化することを仮定しました。この仮説をテストするには、肝、肝硬変、肝炎、および正常肝臓組織からによって配列する重亜硫酸塩 PCR を分離された DNA の GSTP1 プロモーター領域のメチル化状態を比較しました。我々 は、5' 領域の位置-48 nt 3' 地域すべての肝組織におけるメチル化されているに対し遺伝子選択的に肝細胞癌におけるメチル化されている GSTP1 の転写開始部位から, 正常肝と肝癌組織など検討とを発見しました。興味深いことに、我々 は胎児肝と 11 nonhepatic 正常組織由来の DNA はまたによって配列する重亜硫酸塩 PCR を調べたところにメチル化が見つかりました、3' の地域、プロモーターの肝固有のように見えた。プロモーターの 5' 領域をターゲットとメチル化特定の PCR 法を開発、肝細胞癌を含む様々 な病気の肝組織におけるメチル化 GSTP1 遺伝子を定量化するために使用します。我々 3' 領域をターゲットとする試金を使用すると、我々 は 5' のメチル化が見つかりました - GSTP1 プロモーターの終わりだった大幅により 3 ' より具体的 - 終わり (97.1% 対 60%、p < 0.0001 フィッシャーの正確な試験による) 肝細胞癌の鑑別のため (n = 120) 肝炎から (n = 35) と肝硬変 (n = 35)。幸いに、AFP 負 HCC の 33.8 ％ にはでメチル化 GSTP1 遺伝子が含まれています。本研究は、明確にサイトのメチル化肝細胞癌の特異性をおよびどのように特定の肝臓 DNA のメチル化は HCC の検出のためのエピジェネティックの DNA マーカーの勉強するとき考慮されなければならない CpG の場所の重要性を示します。
