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Articles by Tomislav Maricic in JoVE
JoVE General
프라이머 확장 캡처 : 경비 저하 DNA 소스에서 타겟 시퀀스 불러오기
Max-Planck Institute for Evolutionary Anthropology, Leipzig
우리는 우리가 5 Neandertal 개인의 전체 mitochondrial genomes을 재구성하는 데 사용되는 타겟으로 고대 DNA 시퀀스 검색의 방법을 제시한다. 현재 일 인간과 함께 이러한 시퀀스 비교 Neandertals가 장기 낮은 효과적인 인구의 크기 있다고 제안합니다.
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Picograms 하 ㎍에서: 정량 PCR 높은 처리량 시퀀싱의 소재 수요 감소
454 DNA 시퀀싱 하 여 Neandertal 및 거 대 한 유전자를 복구 하려면 현재 노력이 기술의 감도 보여줍니다. 그러나, 루틴 454 시퀀싱 응용 프로그램에는 여전히 그램 양의 초기 자료 필요. 이것은 라이브러리 시퀀싱, 고 대 DNA 및 다른 불 쌍 한 DNA 샘플을 시퀀싱 할 때 비싸고 노동 집약적인 절차를 필요로 하는 측량 454 위한 효과적인 방법의 부족 때문. 여기 우리가 이러한 한계를 효과적으로 제거할 수 있는 정량 PCR 기반 454 시퀀싱 라이브러리 정량화 방법 보고. 우리 분자 숫자와 시퀀싱 라이브러리 Neandertal DNA 추출 물, 세이 지 ditags 및 모든 적정 실행 하지 않고 최적 시퀀싱 수율을 얻는 보노보 genomic DNA에서 파생 된 조각 크기 분포 추정. 이 메서드를 사용 하 여, 454 시퀀싱 수 454 플랫폼에 샘플 처리량 및 프로토콜 개발의 범위를 증가 하는 동안 비용을 절감 함으로써 과감 하 게 적정 실행 없이 초기 자료의 작은 50 세에서 일상적으로 수행할 수 있다. 메서드와 Illumina/Solexa와 ABI 단단한 시퀀싱에도 적용 해야 따라서 세 플랫폼 모두의 접근성을 확대 하는 데 도움이 해야 합니다.
완전 한 Neandertal 미토 콘 드리 아 게놈 시퀀스 높은 처리량 시퀀싱에 의해 결정 됩니다
완전 한 미토 콘 드리 아 (산) 게놈 시퀀스는 개별 38000 세 Neandertal에서 약 0.3 g의 뼈에서 생성 된 DNA의 4.8 g b 중 식별 8341 mtDNA 시퀀스에 재건 됩니다. 조립 순서의 분석을 명백 하 게 Neandertal mtDNA 현존 인간 Mtdnas의 편차를 벗어나는 고 140000 년 + 660,000의 두 mtDNA 계보 사이 분기 날짜 견적을 수 있도록 설정 합니다. Mtdna에 인코딩된 13 단백질의 소 단위 2 미토 콘 드리 아 전자 수송 체인의 시 토 크롬 c 산화 효소 Neandertals에서 분리 이후 인간의 조상에 아미노를 함유한 산 성 대체의 가장 큰 수를 경험 했다. 증거는 Neandertals의 효과적인 인구 크기는 작은 제안 다른 영장류 계보에 비해 정화 mtDNA 감소 했다 Neandertal의 선택 이다.
최적화 454 라이브러리 준비에서 소량의 DNA 시퀀싱의 두 DNA 물가의 순서 결정을 수 있습니다
적은 양의 DNA를 시작에서 454 기술에 의해 생성 된 DNA 시퀀스의 수익률을 높이려면 우리 454 라이브러리 준비 프로세스의 각 단계 마다의 효율성 조사. 우리 마지막 단계, NaOH, 단일 가닥 라이브러리를 놓으면 비효율적이 고 높은 변수 찾을. 이 단계는 열 처리로 대체 됩니다, 도서관 금액 극적으로 증가. 또한, 처음 시퀀싱 템플릿은 NaOH 처리 하 고 그 후 열 처리에 의해 격리 된 때 개별 서식 파일 DNA 분자의 두 가닥의 시퀀스를 확인할 수 있습니다. 이 방법을 사용 하 여, C/G 자료 쌍 T으로 관찰 / 네안데르탈인 DNA 순서 자료 쌍은 guanine 보다 시 잔류물의 수정으로 인해 확인.
대상된 검색 및 5 개의 Neandertal MtDNA 유전자의 분석
Neandertal DNA의 분석 조사 hominins,이 그룹의 인구 역사를 위한 중대 한 잠재력을 보유 하 고 있지만 진행 샘플 및 DNA의 손상된 상태의 희귀 한 때문에 제한 되었습니다. 우리 대상된 고 대 DNA 시퀀스 검색 샘플 파괴 및 시퀀싱 요구 사항을 크게 감소 시키는 방법을 제시 하 고이 메서드를 사용 하 여 그들의 지리적 범위에 걸쳐 완전 한 미토 콘 드리 아 DNA (mtDNA) 게놈에서 5 Neandertals의 재구성. 우리는 mtDNA 유전자 다양성 38000 70000 년 전에 살았던 Neandertals에는 약 1 / 3는 현대 현대 인간에서 찾을. MtDNA 단백질 진화의 분석, 함께 이러한 데이터 Neandertals의 장기 효과적인 인구 크기는 현대 인간과 현존 유인원의 그것 보다 더 작은 것이 좋습니다.
Kostenki, 러시아에서 이른 현대 인간의 완전 한 MtDNA 게놈
초기 현대 인간 (EMHs)에서 DNA 시퀀스를 복구 Neandertals 같은 고리 타 분 한 그룹으로 그들의 상호 작용 및 현재 인간의 인구에 게 그들의 관계에 주실 수 있습니다. 그러나, 이러한 실험 현재의 인간의 DNA는 자주 뼈 [1, 2] 오염 때문에 매우 문제가 있습니다. 예를 들어, 최근 연구 미토 콘 드리 아 (산) DNA의 신석기 시대 유럽 해골, 시퀀스 변종만 찍은 정통 그들이 결 석 하거나 현재 인구에서 드문 반면 다른 했다 할인 가능한 오염 [3, 4]에서. 이 드문 시퀀스를 들고 EMH 개인 분석을 제한 하 고 따라서 수익률은 고 대 유전자 풀의 한쪽으로 치우친된 보기. DNA, 모든 개인에 게로 서 샘플을 접촉 하는 유전형 등 오염 식별의 다른 접근 제한 분석 표본 이것이 가능 [5, 6] 오염에 대 한 모든 가능한 소스를 제외 하 고. Neandertal 남아, 어디로 오염 및 생 DNA 시퀀스에 의해 구분할 수 있습니다에 Mtdna를 공부 함으로써 우리는 조각화 패턴 및 뉴클레오티드 misincorporations 고 대 DNA 시퀀스의 신뢰성을 측정 하기 위해 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 우리는 러시아에서 Kostenki 14 사이트에서 약 30000 세 EMH에서 완전 한 mtDNA 시퀀스를 확인 하려면 이러한 기능을 사용.
Neandertal 게놈의 초안 시퀀스입니다
Neandertals, 현재의 인간의 진화 가까운 친척 30000 년 전에 사라져 전에 유럽과 서 부 아시아의 많은 부분에서 살 았습니다. 우리는 게놈에서 3 개인이 4 억 개 이상의 뉴클레오티드로 구성 하는 Neandertal의 초안 순서 현재. 세계의 다른 부분에서 5 현대 인간의 게놈을 Neandertal 게놈 비교 조상 현대 인간, 신진 대사에 관련 된 유전자를 등 인지 및 골격 발달에 긍정적인 선택에 의해 영향을 수 있는 게놈 영역 수를 식별 합니다. 우리는 Neandertals 사하라 사막 이남의 아프리카에서 현재의 인간 보다는 유라시아에서 현재의 인간은 더 많은 유전자 변형 공유 비 아프리카 조상에 Neandertals에서 유전자 흐름 발생 유라시아 그룹의 발산 하기 전에 서로 제안 보여줍니다.
배열 기반 시퀀스 캡처에 의해 Neandertal 게놈의 타겟된 조사
이제 멸종 생물에 대 한 특정 게놈 영역 캡처로 전체 게놈 샷건 시퀀싱을 수행 하는 것이 가능 합니다. 그러나, 핵 유전자의 큰 부분의 타겟 resequencing 아직 고 대 DNA에 대 한 증명 해야 한다. 여기 우리가 microarrays에 교 잡 캡처의 약 99.8% 미생물 DNA의 존재도 DNA Neandertal에서에서 대상 영역 megabase 보다 더 복구 성공적으로 수 있습니다 보여줍니다. 이 방법을 사용 하면 약 14000 단백질 코딩 위치 침팬지와 함께 공유 하는 마지막 공통 조상 이후 인간의 혈통에 변경으로 유추 시퀀스 한 우리. 한 Neandertal와 50 현재의 인간이이 위치에서의 시퀀스를 생성 하 여 우리 인간에서를 Neandertals에서 우리의 분기 이후 고정 되는 88 아미노를 함유한 산 성 대체를 확인 했습니다.
다중화 된 DNA 시퀀스의 미토 콘 드리 아 유전자 PCR 제품을 사용 하 여 캡처
높은 처리량 시퀀서의 기능을 활용 하려면 대상 농축 방법 개발 되었습니다. 이들의 대부분 시 약 및 장비 에서만 상용 공급 업체에서 사용할 수 있는 요구 하 고 길이에 몇 kilobases 대상에 적합 하지 않습니다.
시베리아에서 Denisova 동굴에서 고리 타 분 Hominin 그룹의 유전적 인 역사
남부 시베리아에서 Denisova 동굴에서 발견 손가락 뼈에서 추출한 DNA를 사용 하 여, 약 1.9-fold 범위에 고리 타 분 hominin 게놈 시퀀스 한 우리. 이 개인은 원시인으로 일반적인 출처를 공유 하는 그룹에서. 이 인구는 Eurasians;에 원시인에서 상 유전자 흐름에 관여 하지 않습니다. 그러나, 데이터는 현재의 멜라네시아의 유전자에는 유전 물질의 4-6% 기여 것이 좋습니다. 우리 'Denisovans'이 hominin 인구를 지정 하 고 그 되었을 수도 있습니다 아시아에서 광범위 하 게 늦게 훙 적 세 시대 동안는 것이 좋습니다. Denisova 동굴에서 발견 된 치아 운반 미토 콘 드리 아 게놈 손가락 뼈의 매우 비슷합니다. 이 이빨이 원시인 또는 추가 나타내는 Denisovans 원시인과 현대 인간 다를 진화 역사를가지고 현대 인간 아니 파생된 형태소 기능을 공유 합니다.
