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Articles by Tommi A. White in JoVE
JoVE Immunology and Infection
Détermination des structures moléculaires des glycoprotéines d'enveloppe du VIH en utilisant microscopie cryo-électronique et automatisée Sous-tomogramme moyenne
1Laboratory of Cell Biology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2The Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit, University of Cambridge, 3National Library of Medicine, National Institutes of Health, 4Massachusetts Institute of Technology, 5William Fremd High School, 6University of Virginia, 7Duke University, 8Yale University, 9University of Notre Dame, 10Washington University in St. Louis, 11Bioinformatics and Computational Biosciences Branch, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 12Thomas Jefferson High School for Science and Technology
Le protocole décrit une approche à haut débit pour déterminer les structures des protéines membranaires par cryo-tomographie électronique et traitement d'images 3D. Il couvre les détails de la préparation des échantillons, collecte, traitement et interprétation des données, et se termine par la production d'une cible représentant de l'approche, le VIH-1 glycoprotéine d'enveloppe. Ces procédures de calcul sont conçues d'une façon qui permet aux chercheurs et aux étudiants de travailler à distance et de contribuer au traitement des données et l'analyse structurale.
Other articles by Tommi A. White on PubMed
Traitement Aigu Et Chronique Des Souris Ob/ob Et Db/db Avec AICAR Diminue La Glycémie
L'enzyme 5'AMP-activated protein kinase (AMPK) est activée par l'augmentation de la concentration intracellulaire d'AMP par l'interaction complexe de la phosphorylation et la régulation allostérique. Actions de l'AMPK élucidé à ce jour suggèrent que l'AMPK peut être une cible viable pour une intervention pharmacologique dans le diabète de type II. Activation de l'AMPK est censée interviennent dans les deux l'augmentation aiguë de l'absorption du glucose du muscle squelettique pendant l'exercice, ainsi que les réponses adaptatives pour l'exercice chronique comme la régulation de l'expression des composantes du système de captation de glucose musculaire. En outre, l'AMPK est connu pour inhiber les enzymes clés impliquées dans la synthèse de lipides et de cholestérol, ce qui suggère que l'activation de cette kinase peut-être également atténuer les dyslipidémie. Pour étudier les effets de l'activation de l'AMPK dans des modèles animaux de type II diabetes, db/db et ob/ob souris était administrée 5-aminoimidazole-4-carboxamide 1-beta-ribofuranoside (AICAR) par voie sous-cutanée soit aiguë (une seule injection) ou deux fois par jour pendant 8 jours (traitement chronique). La glycémie a été abaissée transitoirement dans deux db/db et souris ob/ob par traitement AICAR, regagner basale niveaux environ 3 h après l'administration de AICAR. En réponse à un traitement chronique, la glycémie (mesurée à 18 h post-AICAR administration) a été significativement réduite dans les deux modèles de souris par rapport aux groupes de contrôle de véhicule, glycémie matin valeurs sur 8 jours mis a diminué environ de 30 à 35 % dans les deux modèles de souris. L'administration chronique AICAR a également entraîné une élévation de la concentration totale de Glut4 dans le muscle squelettique de souris ob/ob, mais la souris pas db/db. À la différence des effets bénéfiques sur le métabolisme du glucose, traitement AICAR des souris db/db et ob/ob a conduit à une augmentation d'environ 2,5 à 3 fois dans les taux de triglycérides sériques par rapport aux témoins traités avec le véhicule. Ces données suggèrent que pharmacologique activation de l'AMPK peut augmenter l'absorption de glucose chez les personnes atteintes de diabète de type II, cependant, cet avantage peut être compensé par l'élévation concomitante de triglycérides.
Structures D'Escherichia Coli PutA Proline Déshydrogénase Matière Complexe Avec Des Inhibiteurs Compétitifs
Proline déshydrogénase (PRODH) catalyse la première étape du catabolisme de la proline, l'oxydation de la flavine-dépendante de la proline à Delta (1) - pyrroline - 5-carboxylate. Nous présentons ici une étude basée sur la structure du site actif PRODH de l'Escherichia coli multifonctionnel utilisation proline une protéine (PutA) à l'aide de la cristallographie aux rayons x, mesures de cinétique enzymatique et mutagenèse dirigée. Structures du domaine PutA PRODH complexé avec l'acétate d'inhibiteurs compétitifs (k = 30 mM), L-lactate (k = 1 mM) et acide L-tétrahydro-2-furoïque (L-EDPNTH, k = 0,2 mM) ont été déterminées à haute résolution limites de 2,1 à 2,0 A. La découverte d'un inhibiteur compétitif de l'acétate suggère que le carboxyle est le groupe fonctionnel minimum reconnu par le site actif, et les structures montrent comment l'enzyme exploite des interactions polaires et liaison hydrogène afin d'optimiser l'affinité pour le substrat. Le complexe PRODH/L-EDPNTH est la première structure de PRODH avec un analogue de proline cinq chaînons lié au site actif et offre ainsi de nouveaux aperçus de la reconnaissance du substrat et le mécanisme catalytique. L'anneau de la L-EDPNTH est presque parallèle à l'anneau central de la FAD d-ribotétrahydroxy-2,3,4,5-pentyl)-10-isoalloxazine, avec l'atome de C5 inhibiteur 3.3 A de la FAD N5. Cette géométrie suggère transfert d'hydrure direct comme un mécanisme plausible. Mutation des résidus du site actif conservé Leu432 Pro a provoqué une diminution de 5 fois en k(cat) et une perte sévère dans thermostabilité. Ces changements sont conformes à l'emplacement de Leu432 dans le noyau hydrophobe près de résidus de contacter directement le FAD. Nos résultats suggèrent que la base moléculaire pour une augmentation plasmatique de proline chez les sujets schizophrènes porteurs de la mutation faux-sens à que l441p est dû a diminué de stabilité de PRODH2 humaine.
Explorer Structurellement Conservé Des Sites De Solvants Dans Les Familles De Protéines
Les molécules d'eau liés aux protéines sont des éléments importants de la structure des protéines et par conséquent, la fonction des protéines et énergétiques. Bien que la conservation structurale du solvant a été étudiée dans plusieurs familles de protéines, un manque d'outils informatiques appropriés a entravé des analyses plus approfondies. Ici, nous présentons une approche computationnelle semi-automatique pour identifier les sites de solvants qui sont conservées entre les protéines partage une structure commune en trois dimensions. Cette méthode a été testée sur six familles de protéines : monodomaine (1) du cytochrome c, protéine de liaison des acides gras (2), (3) lactate/malate déshydrogénase parvalbumine (4), (5) la phospholipase A2 et protéase de sérine (6). Pour chaque famille, la méthode identifiée avec succès sites solvants conservés précédemment connus. Par ailleurs, la méthode découvert 22 nouveaux sites solvants conservées, dont certaines ont des degrés plus élevés de conservation que les sites déjà connus. Tous les six familles étudiées avaient solvant avec plus de 90 % conservation et ces sites se trouvaient toujours dans les régions de la protéine avec conservation de séquence très élevé. Ces résultats suggèrent que les sites de solvants hautement conservées, en raison de leur proximité aux résidus conservés, soit considérées comme l'une des caractéristiques structurelles tridimensionnels définition des familles de protéines et de plis.
Structure Et Cinétique De Monofonctionnel Proline Déshydrogénase De Thermus Thermophilus
Proline déshydrogénase (PRODH) et Delta 1-pyrroline-5-carboxylate déshydrogénase (P5CDH) catalysent l'oxydation en deux étapes de proline au glutamate. Ils sont des enzymes monofonctionnel distinctes dans tous les eucaryotes et certaines bactéries mais sont fusionnées bifonctionnels enzymes appelées utilisation proline un (PutA) chez d'autres bactéries. Nous présentons la première structure et les données biochimiques pour un monofonctionnel PRODH. La structure 2.0-résolution de Thermus thermophilus PRODH révèle une déformée (betaalpha)(8) baril core catalytique et un domaine hydrophobe d'alpha-hélicoïdal située au-dessus les extrémités c-terminal des brins du canon. Bien que le noyau catalytique est similaire à celui du domaine de PutA PRODH, la conformation de la FAD de T. thermophilus PRODH est remarquablement différentes et probablement reflètent les exigences particulières pour l'association de la membrane et de la communication avec les P5CDH. En outre, la manie des T. thermophilus PRODH est hautement exposé au solvant comparée à PutA en raison d'une 4 Maj d'hélice 8. Analyse de la séquence basée sur la structure de la famille PutA/PRODH nous a conduit à identifier des neuf motifs conservés impliqués dans la reconnaissance de cofacteur et le substrat. Les études biochimiques montrent que le potentiel de point médian du FAD -75 mV et les paramètres cinétiques pour la proline sont K(m) = 27 mm et k(cat) = 13 s(-1). 3,4-Déhydro-l-proline s'est avéré pour être un substrat efficace et l-tétrahydro-2-furoïque, acide est un inhibiteur compétitif (k = 1. 0 mm). Finalement, nous démontrons que thermophilus T. PRODH réagit avec o (2) production de superoxyde. Ceci est important car la production de superoxyde sous-tend le rôle de PRODH humaine dans l'apoptose induite par la p53, ce qui implique des points communs entre les bactéries et eucaryotes monofonctionnel PRODHs.
Base Structurale Pour L'inactivation De Thermus Thermophilus Proline Déshydrogénase Par N-propargylglycine
Le flavoenzymes proline déshydrogénase catalyse la première étape du catabolisme de la proline, l'oxydation de la proline en pyrroline-5-carboxylate. Nous présentons la première structure cristalline d'une déshydrogénase proline irréversiblement inactivée. Le 1.9 une structure de résolution de Thermus thermophilus proline déshydrogénase inactivé par l'inhibiteur axée sur le mécanisme de N-propargylglycine indique que N5 de cofacteur de la flavine est par covalence connecté au - groupement amino de Lys99 via une liaison de trois carbones, cohérente avec l'analyse de spectre de masse de l'enzyme inactivée. L'anneau de d-ribotétrahydroxy-2,3,4,5-pentyl)-10-isoalloxazine a un angle de papillon de 25 degrés, ce qui suggère que le cofacteur flavin est réduit. Deux mécanismes peuvent expliquer ces observations. Dans les deux, N-propargylglycine N-propargyliminoglycine est oxydé. Dans un mécanisme, cette iminium alpha, bêta-insaturé composé est attaqué par l'atome N5 de la flavine maintenant réduite à produire un produit d'addition. Formation de base de Schiff entre Lys99 et l'imine du produit d'addition libère glycine et relie l'enzyme à la flavine modifiée. Dans le second mécanisme, hydrolyse de la N-propargyliminoglycine donne propynal et la glycine. Une réaction d'addition 1,4 avec propynal couplé avec formation de base de Schiff entre Lys99 et les sangles du groupement carbonyle de l'enzyme de la flavine via une chaîne de trois carbones. L'hydrolyse non-enzymatique présumé de N-propargyliminoglycine et la reliaison subséquente du propynal à l'enzyme font de ce dernier mécanisme moins probable.
Structure Cristalline De La Proline Bifonctionnels Utilisation A Flavoenzymes De Bradyrhizobium Japonicum
La proline bifonctionnels catabolique flavoenzymes, utilisation proline un (PutA), catalyse l'oxydation de la proline au glutamate via l'activité séquentielle de FAD-dépendante proline déshydrogénase (PRODH) et NAD (+)-domaines de déshydrogénase (P5CDH) dépendants Delta 1-pyrroline-5-carboxylate. Bien que les structures pour certains des domaines de PutA sont connus, une structure pour la protéine pleine longueur n'a pas déjà été résolue. Nous rapportons ici le 2.1 une résolution crystal structure de PutA de Bradyrhizobium japonicum, ainsi que les données de diffusion petits angles des rayons x, ultracentrifugation analytique et cinétique de l'équilibre et la force de réaction rapide. PutA constitue un tétramère en forme d'anneau dans une solution ayant un diamètre de 150 A. Au sein de chaque protomère, les sites actifs PRODH et P5CDH font face à une distance de 41 A et sont reliés par une cavité large, de forme irrégulière. Les mesures de cinétique montrent que la production de glutamate se produit sans une phase de latence, ce qui suggère que l'intermédiaire, Delta 1-pyrroline-5-carboxylate, est préférence transféré au domaine P5CDH plutôt libéré dans le milieu en vrac. Les données structurales et cinétiques impliquent que la cavité sert aussi bien comme un navire microscopique pour l'hydrolyse du Delta 1-pyrroline-5-carboxylate de glutamate semialdéhyde et une conduite protégée pour le transport de glutamate semialdéhyde au site actif P5CDH.
Architectures Moléculaires De Trimère SIV Et Glycoprotéines D'enveloppe Du VIH-1 Sur Les Virus Intacts: La Souche-dépendante Variation De La Structure Quaternaire
L'étape initiale de l'infection des cellules cibles par les activités humaines, et les simiens étroitement liées virus de l'immunodéficience (VIH et SIV, respectivement) se produit avec la liaison de glycoprotéines d'enveloppe trimériques (Env), composée d'hétérodimères de la glycoprotéine transmembranaire virale (gp41) et la glycoprotéine de surface (gp120) pour cibler des cellules T. La connaissance de la structure moléculaire de trimérique Env sur les virus intactes est important tant pour la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents interactions virus-cellules et pour la conception de efficaces immunogène des vaccins à base de lutte contre le VIH / SIDA. Les analyses précédentes de intactes virions VIH-1 Bal ont déjà abouti à des structures de trimérique Env dans les Etats sans ligand et CD4-ligandé à ~ 20 Å de résolution. Ici, nous montrons que les architectures moléculaires de trimérique Env de SIVmneE11S, SIVmac239 et le VIH-1 souches R3A sont étroitement comparable à celle déterminée au préalable pour le VIH-1 Bal, avec la variable V1 et V2 boucles situé à l'apex de la pointe, à proximité à la zone de contact entre le virus et des cellules. L'emplacement des V1/V2 boucles dans trimérique Env a été définitivement confirmé par l'analyse structurale des virions VIH-1 R3A modifiées pour exprimer Env avec la suppression de ces boucles. Il est frappant, dans SIV CP-MAC, une souche CD4-indépendante, trimérique Env est dans un constitutivement conformation «ouverte» avec la gp120 trimères évasées dans une conformation similaire à celle observée pour le VIH-1 Env BaL quand il est complexé avec sCD4 et le 17b anticorps CD4i. Nos résultats suggèrent une explication structurelle pour le mécanisme moléculaire de CD4-indépendante l'entrée du virus et en outre établir que microscopie cryo-électronique peut être utilisée pour découvrir distinctes et fonctionnellement pertinents structures quaternaires de Env affichées sur les virus intacts.
Les Structures Tridimensionnelles De CD4 Soluble Assortis États De Trimères De L'immunodéficience Simienne Glycoprotéines D'enveloppe De Virus Déterminée En Utilisant Microscopie Cryo-électronique
Les trimères d'enveloppe glycoprotéine (Env) pointes affichée sur les surfaces des virus de l'immunodéficience simienne (SIV) et humaine de type virus de l'immunodéficience 1 (VIH-1) virions sont composés de trois hétérodimères des glycoprotéines virales gp120 et gp41. Bien que la liaison de la gp120 au CD4 de la surface cellulaire et un récepteur de chimiokine est connu pour induire des changements conformationnels dans la gp120 et gp41, changements dans la structure quaternaire de la trimère n'ont que récemment été élucidé. Pour le VIH-1 BaL isoler, les résultats de CD4 de fixation dans un réarrangement de frappe du trimère d'un «fermé» à une conformation «ouverte». L'effet de CD4 sur trimères SIV, cependant, n'a pas été décrite. Utilisation de la tomographie cryo-électronique, nous avons maintenant déterminé architectures moléculaires des CD4 soluble (sCD4) des états liés de trimères Env SIV pour trois souches différentes (SIVmneE11S, SIVmac239, et SIV CP-MAC). En contraste marqué avec le VIH-1 Bal, SIVmneE11S et SIVmac239 Env montré que de faibles changements conformationnels qui suivent sCD4 contraignant. En SIV CP-MAC, où trimérique Env affiche un constitutivement conformation «ouverte» similaire à celui observé pour le VIH-1 BaL Env dans l'état sCD4 complexé, nous montrons qu'il n'y a pas d'autres changements importants dans la conformation sur la liaison de l'une des sCD4 ou 7D3 anticorps. Les cartes de densité montrent également que 7D3 et 17b épitopes cibles des anticorps sur la gp120 qui sont sur les côtés opposés du site corécepteur contraignant. Ces résultats fournissent de nouveaux aperçus sur la diversité structurelle des SIV Env et de montrer qu'il ya souche-dépendants des variations de l'orientation de sCD4 liés à trimérique SIV Env.
Séparation De Calcul De L'hétérogénéité Conformationnelle De Microscopie Cryo-électronique Et 3D Sous-volume De Calcul De La Moyenne
Nous avons déjà utilisé la tomographie cryo-électronique combiné avec sous-volume moyenne et la classification d'obtenir des structures 3D des assemblages macromoléculaires dans les cas où une seule espèce dominante était présent, et a appliqué ces méthodes à l'analyse d'une variété de trimérique VIH-1 et SIV glycoprotéines d'enveloppe (ENV). Ici, nous étendons ces études en démontrant automatisé, itérative, manquant de coin corrigée alignement de l'image 3D et les méthodes de classification pour distinguer plusieurs conformations qui sont présents simultanément. Nous présentons une méthode pour mesurer la distribution spatiale des éléments vectoriels représentant distinctes états conformationnels de Env. Nous identifions le traitement des données des stratégies qui permettent une séparation claire des conformations déjà caractérisés fermées et ouvertes, ainsi que les Etats sans ligand et l'anticorps-ligandé de Env quand ils sont présents dans les mélanges. Nous montrons que l'identification et à éliminer des crêtes avec les plus faibles du signal sur bruit améliore la précision globale de l'alignement entre les différents sous-Env volumes, et que la précision d'alignement, à son tour, détermine le succès de la classification d'images dans l'évaluation de l'hétérogénéité conformationnelle dans des mélanges hétérogènes . On valider ces procédures de séparation de calcul par succès de séparation et la reconstruction des structures distinctes 3D pour conformations sans ligand et un anticorps-ligandé et ouverte et fermée de Env présents simultanément dans des mélanges.
