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Articles by Tommi A. White in JoVE
JoVE Immunology and Infection
Determinazione di strutture molecolari di glicoproteine dell'HIV Busta con Cryo-Electron Positron e automatizzato Sub-tomogramma Averaging
1Laboratory of Cell Biology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2The Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit, University of Cambridge, 3National Library of Medicine, National Institutes of Health, 4Massachusetts Institute of Technology, 5William Fremd High School, 6University of Virginia, 7Duke University, 8Yale University, 9University of Notre Dame, 10Washington University in St. Louis, 11Bioinformatics and Computational Biosciences Branch, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 12Thomas Jefferson High School for Science and Technology
Il protocollo descrive un approccio high-throughput per determinare le strutture di proteine di membrana con crio-elettroni tomografia ed elaborazione delle immagini 3D. Esso copre i dettagli della preparazione dei campioni, raccolta, elaborazione e interpretazione dei dati, e si conclude con la produzione di un bersaglio rappresentante per l'approccio, l'HIV-1 glicoproteina Busta. Queste procedure di calcolo sono stati progettati in un modo che consente ai ricercatori e agli studenti di lavorare in remoto e contribuire alla elaborazione dei dati e l'analisi strutturale.
Other articles by Tommi A. White on PubMed
Trattamento Acuto E Cronico Di Topi Ob/ob E Db/db Con AICAR Diminuisce La Concentrazione Di Glucosio Del Sangue
L'enzima 5'AMP-attivato proteina chinasi (AMPK) è attivato dall'aumento della concentrazione intracellulare di AMP attraverso una complessa interazione di fosforilazione e regolazione allosterica. Azioni di AMPK chiarito finora suggeriscono che AMPK può essere un obiettivo realizzabile per intervento farmacologico nel diabete di tipo II. Attivazione di AMPK è creduto di mediare sia l'aumento acuto nell'assorbimento del glucosio muscolare scheletrico durante l'esercizio, come pure le risposte adattative all'esercizio cronica come la regolazione dell'espressione dei componenti del sistema di assorbimento del glucosio muscolare. Inoltre AMPK è noto per inibire gli enzimi chiavi coinvolti nella sintesi di lipidi e di colesterolo, suggerendo che l'attivazione di questa chinasi può anche migliorare dislipidemia. Per studiare gli effetti di attivazione di AMPK in modelli animali di tipo II diabete, db/db e ob/ob topi erano amministrati 5-aminoimidazole-4-carbossamide 1-beta-ribofuranoside (AICAR) per via sottocutanea o acutamente (singola iniezione) o due volte al giorno per 8 giorni (trattamento cronico). Glucosio nel sangue è stato abbassato transitoriamente in entrambi db/db e topi ob/ob di trattamento acuto AICAR, tornando al basale livelli circa 3 ore dopo la somministrazione di AICAR. In risposta a trattamento cronico, glucosio nel sangue (misurata h 18 post-AICAR amministrazione) era significativamente diminuito in entrambi i modelli del mouse rispetto ai gruppi di controllo del veicolo, con glicemia mattina valori su 8 giorno essendo diminuito circa 30-35% in entrambi i modelli del mouse. Somministrazione cronica di AICAR ha provocato anche un'elevazione della concentrazione totale di Glut4 nel muscolo scheletrico da topi ob/ob, ma topi db/db non. In contrasto con gli effetti benefici sul metabolismo del glucosio, AICAR trattamento di topi db/db e ob/ob ha portato a circa 2,5-3 volte in aumento nei livelli sierici di trigliceridi rispetto ai controlli trattati con veicolo. Questi dati suggeriscono che farmacologico attivazione di AMPK possa aumentare l'assorbimento del glucosio nei soggetti con diabete di tipo II, tuttavia, questo vantaggio può essere compensato con la concomitante elevazione in trigliceridi.
Strutture Del Dominio Escherichia Coli PutA Prolina Deidrogenasi Nel Complesso Con Inibitori Competitivi
Deidrogenasi di prolina (PRODH) catalizza la seguente il primo passo del catabolismo della prolina, l'ossidazione di flavina-dipendenti di prolina a Delta (1) - pirrolina - 5-carbossilato. Qui vi presentiamo uno studio basati sulla struttura del sito attivo PRODH dell'Escherichia coli multifunzionale utilizzo della prolina una proteina (PutA) utilizzando la cristallografia a raggi x, misure di cinetica enzimatica e mutagenesi luogo-diretta. Strutture del dominio PutA PRODH complessato con acetato di inibitori competitivi (K(i) = 30 mM), L-lattato (K(i) = 1 mM) e L-tetraidro-2-furoic acid (L-THFA, K(i) = 0,2 mM) sono stati determinati limiti ad alta risoluzione a. 2.1-2.0 La scoperta di acetato come un inibitore competitivo suggerisce che il carbossile è il gruppo funzionale minimo riconosciuto dal sito attivo, e le strutture mostrano come l'enzima sfrutta le interazioni di legame idrogeno e non polari per ottimizzare l'affinità per il substrato. Il complesso PRODH/L-THFA è la prima struttura di PRODH con un analogo di prolina five-membered anello legato nel sito attivo e di conseguenza fornisce nuove intuizioni riconoscimento del substrato e il meccanismo catalitico. L'anello di L-THFA è quasi parallelo all'anello centrale di isoalloxazine la FAD, con l'atomo C5 inibitore 3.3 A da N5 FAD. Questa geometria suggerisce diretto idruro trasferimento come un meccanismo plausibile. Mutazione del residuo conservato sito attivo Leu432 a Pro ha causato una diminuzione di 5 volte in k(cat) e una grave perdita in termostabilità. Questi cambiamenti sono coerenti con la posizione di Leu432 nel nucleo idrofobo vicino residui che contattare direttamente la FAD. I nostri risultati suggeriscono che la base molecolare per i livelli di prolina plasma aumentato in schizofrenici soggetti portatori della mutazione missenso che l441p è dovuto alla diminuita stabilità del PRODH2 umano.
Esplorare Strutturalmente Conservati Siti Solvente in Famiglie Di Proteine
Molecole d'acqua associato a proteine sono componenti importanti della struttura della proteina e quindi, la funzione della proteina e l'energetica. Anche se la conservazione strutturale del solvente è stato studiato in alcune famiglie di proteine, una mancanza di idonei strumenti computazionali ha ostacolato più esauriente analisi. Qui vi presentiamo un approccio computazionale semiautomatico per identificare i siti solvente che sono conservate tra le proteine condivisione di una comune struttura tridimensionale. Questo metodo è testato su sei famiglie proteiche: citocromo c (1) monodomain, (2) acido grasso-binding protein, (3) lattato/malato deidrogenasi, parvalbumin (4), (5) fosfolipasi A2 e (6) serina proteasi. Per ogni famiglia, il metodo identificato con successo siti solvente conservati precedentemente conosciuti. Inoltre, il metodo scoperto 22 romanzo siti solvente conservati, alcuni dei quali hanno più alti gradi di conservazione rispetto i siti precedentemente noti. Tutte le sei famiglie studiate avevano solvente con più di 90% conservazione e questi siti erano invariabilmente si trova nelle regioni della proteina con conservazione di sequenza molto alta. Questi risultati suggeriscono che siti solvente altamente conservate, in virtù della loro vicinanza ai residui conservati, dovrebbero essere considerati come una delle caratteristiche distintive tridimensionale strutturale delle famiglie della proteina e le pieghe.
Struttura E Cinetica Di Deidrogenasi Prolina Monofunzionali Da Thermus Thermophilus
Prolina deidrogenasi (PRODH) e Delta (1) - pirrolina - 5-carbossilato deidrogenasi (P5CDH) catalizzano l'ossidazione di due fasi di prolina di glutammato. Sono enzimi monofunzionali distinti in tutti gli eucarioti e alcuni batteri, ma sono fusi in bifunzionali enzimi noti come utilizzo della prolina un (PutA) in altri batteri. Qui riportiamo la prima struttura e dati biochimici per un monofunzionali PRODH. La struttura 2.0-risoluzione di Thermus thermophilus PRODH rivela un distorto (betaalpha)(8) canna core catalitico dominio e un dominio alfa-elicoidale idrofobico si trova sopra l'estremità carbossi-terminale dei fili della canna. Anche se il nucleo catalitico è simile a quello del dominio PutA PRODH, la conformazione di FAD di T. thermophilus PRODH è notevolmente diverso e probabilmente riflette unici requisiti per la comunicazione con P5CDH e associazione di membrana. Inoltre, il FAD di T. thermophilus PRODH è altamente solvente-esposti rispetto a PutA a causa di una 4-A spostamento di elica 8. Analisi di sequenza basata sulla struttura della famiglia PutA/PRODH ci ha portato a identificare nove motivi conservati coinvolte nel riconoscimento di cofattore e substrato. Studi biochimici mostrano che il potenziale di punto mediano della FAD è -75 mV e i parametri cinetici per prolina sono K(m) = 27 mm e k(cat) = s(-1) 13. 3,4-Deidro-l-prolina è stata trovata per essere un efficace substrato, e l-tetraidro-2-furoic acid è un inibitore competitivo (K(I) = 1,0 mm). Infine, noi dimostrare che T. thermophilus che PRODH reagisce con apparato produce superossido. Ciò è significativo perché la produzione di superossido sottende il ruolo di PRODH umana nell'apoptosi mediata da p53, implicando comunanze tra monofunzionali eucariotica e batterica PRODHs.
Base Strutturale Per L'inattivazione Di Thermus Thermophilus Deidrogenasi Prolina Di N-propargylglycine
La deidrogenasi di prolina flavoenzyme catalizza il primo passaggio del catabolismo della prolina, l'ossidazione della prolina a pirrolina-5-carbossilato. Riportiamo la prima struttura di cristallo di una deidrogenasi prolina irreversibilmente inattivati. Il 1,9 una struttura di risoluzione di Thermus thermophilus deidrogenasi prolina inattivati con l'inibitore basata sul meccanismo di N-propargylglycine dimostra che N5 del cofattore flavina covalenza è collegato al - ammino gruppo di Lys99 tramite un collegamento di tre-carbonio, coerenza con l'analisi spettrale di massa dell'enzima inattivato. L'anello di isoalloxazine ha un angolo farfalla di 25 gradi, che suggerisce che il cofattore flavina è ridotto. Due meccanismi possono spiegare queste osservazioni. In entrambi, N-propargylglycine è ossidato a N-propargyliminoglycine. In un meccanismo, questo imminio alfa, beta-insaturo composto viene attaccato dall'atomo N5 della flavina ora ridotta a produrre un prodotto di addizione 1,4. Formazione base di Schiff tra Lys99 e l'immina del prodotto di addizione 1,4 rilascia glicina e collega l'enzima per la flavina modificato. Nel secondo meccanismo, idrolisi di N-propargyliminoglycine produce propynal e glicina. Una reazione di addizione 1,4 con propynal accoppiato con formazione di base di Schiff tra Lys99 e i gruppo carbonilico di attacchi l'enzima per la flavina tramite una catena di tre-carbonio. L'idrolisi del presunto nonenzymatic di N-propargyliminoglycine e la successiva riassociazione di propynal all'enzima rendere meno probabile il meccanismo di quest'ultimo.
Struttura Cristallina Della Prolina Bifunzionale Utilizzazione A Flavoenzyme Da Bradyrhizobium Japonicum
La prolina bifunzionale catabolico flavoenzyme, utilizzazione di prolina un (PutA), catalizza l'ossidazione di prolina a glutammato attraverso l'attività sequenziale di deidrogenasi FAD-dipendente a prolina (PRODH) e NAD (+)-dipendente Delta (1) - pirrolina - 5-carbossilato domini deidrogenasi (P5CDH). Anche se sono noti strutture per alcuni dei domini di PutA, una struttura per il full-length della proteina non ha precedentemente stato risolto. Qui riportiamo la 2.1 una risoluzione crystal struttura di PutA da Bradyrhizobium japonicum, insieme ai dati dalla dispersione small-angle x-ray, ultracentrifugazione analitica e cinetica dello stato stazionario e di reazione rapida. PutA forma un tetramero a forma di anello in soluzione con un diametro di 150 A. All'interno di ogni protomer, i siti attivi PRODH e P5CDH di fronte a altra ad una distanza di 41 A e sono collegati da una cavità di grandi dimensioni, dalla forma irregolare. Cinetica misurazioni mostrano che glutammato produzione avviene senza una fase di lag, suggerendo che l'intermedio, Delta (1) - pirrolina - 5-carbossilato, è preferibilmente trasferito al dominio P5CDH piuttosto che rilasciata nel mezzo alla rinfusa. I dati cinetici e strutturali implicano che la cavità serve sia come una nave microscopica per l'idrolisi del Delta (1) - pirrolina - 5-carbossilato di glutammato semialdeide e un conduttore protetto per il trasporto di glutammato semialdeide al sito attivo P5CDH.
Architetture Molecolari Di Glicoproteine Busta Trimeric SIV E HIV-1 Su Virus Intatto: Ceppo-dipendente Dalla Variazione Nella Struttura Quaternaria
Il passo iniziale per infezione delle cellule bersaglio da umani e il virus dell'immunodeficienza delle scimmie strettamente correlate (HIV e SIV, rispettivamente) si verifica con l'associazione di glicoproteine busta trimeric (Env), composto da eterodimeri della glicoproteina transmembrana virale (gp41) e superficie glicoproteina (gp120) a bersaglio le cellule T. Conoscenza della struttura molecolare di Env trimeric su virus intatto è importante per comprendere i meccanismi molecolari sottostanti le interazioni virus-cellula e per la progettazione di vaccini basati su immunogen efficaci combattere l'HIV/AIDS. Analisi precedenti di virioni di HIV-1 BaL intatte già hanno portato a strutture di Env trimeric in unliganded e CD4-liganded afferma a risoluzione Å ~ 20. Qui, ci mostra che le architetture molecolari di Env trimeric da SIVmneE11S, SIVmac239 e l'HIV-1 R3A ceppi sono strettamente paragonabili a quella determinata in precedenza per BaL di HIV-1, con la V1 e V2 cicli variabile si trovano all'apice del picco, vicino alla zona di contatto tra virus e cellula. La posizione delle anse V1/V2 in Env trimeric fu definitivamente confermata dall'analisi strutturale dei virioni di HIV-1 R3A ingegnerizzato di Env espressa con eliminazione di questi cicli. Sorprendentemente, in SIV CP-MAC, un ceppo di CD4-indipendente, Env trimeric è in una conformazione costitutivamente "aperta" con gp120 trimeri strombate in una conformazione simile a quello visto per Env di HIV-1 BaL quando è complessato con sCD4 e il CD4i anticorpo 17b. I nostri risultati suggeriscono una spiegazione strutturale per il meccanismo molecolare di entrata virale CD4-indipendente e ulteriormente stabilire che tomografia del cryo-elettrone può essere utilizzata per scoprire distinte, funzionalmente rilevanti strutture quaternarie di Env visualizzati su virus intatto.
Strutture Tridimensionali Degli Stati Associati a CD4 Solubili Di Glicoproteine Di Busta Del Virus Dell'immunodeficienza Delle Scimmie Trimeric Determinate Mediante Tomografia Computerizzata Cryo-elettrone
Le punte di glicoproteina (Env) trimeric busta visualizzate sulla superficie del virus dell'immunodeficienza delle scimmie (SIV) e virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) virioni sono composte da tre eterodimeri di glicoproteine virali gp120 e gp41. Anche se il legame di gp120 di cellule CD4 superficiale e un recettore delle chemochine è noto per provocare alterazioni conformazionali gp120 e gp41, cambiamenti nella struttura quaternaria di trimero solo di recente sono state chiarite. Per isolare il BaL di HIV-1, CD4 attaccamento provoca un riarrangiamento colpisce il trimero da un "chiuso" ad una conformazione "aperta". L'effetto di CD4 su trimeri SIV, tuttavia, non è stata descritta. Utilizzando la tomografia cryo-elettrone, ora abbiamo determinato architetture molecolari del CD4 solubile (sCD4)-Stati di SIV Env trimeri per tre diversi ceppi (SIVmneE11S, SIVmac239 e SIV CP-MAC) legati. In netto contrasto con l'HIV-1 BaL, SIVmneE11S e SIVmac239 Env ha mostrato solo lievi cambiamenti conformazionali seguendo sCD4 associazione. In SIV CP-MAC, dove Env trimeric Visualizza una conformazione costitutivamente "aperta" simile a quello visto per Env di HIV-1 BaL nello stato sCD4-complessato, ci mostra che non ci sono cambiamenti significativi ulteriori nella conformazione dell'associazione del sCD4 o 7 3 anticorpo. Le mappe di densità mostrano anche che gli anticorpi 3 7 e 17b target epitopi su gp120 che sono su lati opposti del sito Associazione coreceptor. Questi risultati forniscono nuove intuizioni della diversità strutturale di SIV Env e mostrano che ci sono dipendenti dal ceppo variazioni nell'orientamento di sCD4 associato a trimeric SIV Env.
Separazione Computazionale Di Eterogeneità Conformazionale Mediante Tomografia Cryo-elettrone E Sub-volume 3D in Media
In precedenza abbiamo usato tomografia cryo-elettrone, combinata con una media di sub-volume e classificazione per ottenere strutture 3D delle assemblee macromolecolare in casi dove era presente una sola specie dominante e applicato questi metodi per l'analisi di una varietà di trimeric HIV-1 e SIV busta glicoproteine (Env). Qui, noi estendere questi studi dimostrando automatizzati, iterativi, manca di metodi di allineamento e classificazione Cuneo-correzione immagine 3D per distinguere molteplici conformazioni che sono presenti contemporaneamente. Vi presentiamo un metodo per misurare la distribuzione spaziale degli elementi vettoriali che rappresentano stati conformazionali distinti di Env. Noi identificare strategie di elaborazione dei dati che permettono di chiare separazione di precedentemente caratterizzato chiuso e aprire conformazioni, come pure unliganded e anticorpo-liganded stati di Env quando sono presentano in miscele. Mostriamo identificazione e rimozione di picchi con il più basso rapporto segnale-rumore migliora l'accuratezza complessiva di allineamento tra i singoli sub-volumi Env, che tale precisione di allineamento, a sua volta, determina il successo di classificazione di immagine nel valutare conformazionali eterogeneità nei miscugli eterogenei. Noi convalidare queste procedure per separazione computazionale con successo separando e ricostruendo distinte strutture 3D per unliganded e anticorpo-liganded, come pure le conformazioni aperte e chiuse di Env presenti simultaneamente in miscele.
