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Articles by Toru Kariu in JoVE
JoVE Immunology and Infection
Methoden zur raschen Transfer und die Lokalisierung von Lyme-Borreliose Erreger innerhalb der Tick Gut
1Department of Veterinary Medicine, University of Maryland, 2Department of Entomology, Connecticut Agricultural Experiment Station
Lyme-Borreliose Studien erfordern oft Generation von Zecken mit dem Erreger Borrelia burgdorferi, ein Prozess, der dauert in der Regel mehrere Wochen infiziert. Hier zeigen wir eine Mikroinjektion-basierte Zecken Infektion Verfahren, das innerhalb weniger Stunden erreicht werden kann. Wir zeigen auch einer Immunfluoreszenz-Methode zur in situ-Lokalisation von B. burgdorferi in Zecken.
Other articles by Toru Kariu on PubMed
Insel Besonderer Ausdruck Des Einen Roman [Lys(49)]-Phospholipase A(2) (BPIII) in Protobothrops Flavoviridis Gift in Amami-Oshima, Japan
Auf der Suche nach den Abschriften, ausgedrückt in Protobothrops Flavoviridis Gift Drüse wurden 466 exprimierten Sequenz-Tags (ESTs) Gift Drüse cDNA Library of s. Flavoviridis in Amami-Oshima, Japan erzeugt. Die Sequenzierung von zufällig ausgewählten cDNA Klonen gefolgt von Identifikation in Ähnlichkeitsrecherche für vorhandene Datenbanken führte zum finden von einem neuartigen Lysin-49-Phospholipase A(2) ([Lys(49)]PLA(2)) Klon. Es kodiert für eine Aminosäure-substituierte BPII Homolog oder zwei Aminosäuren-substituierte BPI Homolog in der BPII und BPI [Lys(49)] PLA (2) s enthaltenen Amami-Ōshima und Tokunoshima P. Flavoviridis Venena geraten. Dieses Isoenzym, benannt BPIII, wurde isoliert aus Amami-Ōshima s. Flavoviridis Gift. BPIII gab eine spezifische [M+2H](2+) Peak m/Z 736.3 auf Massenspektrometrie (MS)-Analyse nach S-Carboxamidomethylation und Trypsin-Verdauung BPII gegenüber. Trypsin-Verdauung der gemischte Protein Gipfel von BPI bis hin zu BPII gewonnenen Fraktionierung an einer Carboxymethyl Cellulose Amami-Ōshima und Tokunoshima P. Flavoviridis Venena, dass BPIII Protein in Amami-Ōshima s. Flavoviridis Gift aber nicht in Tokunoshima P. Flavoviridis Gift enthalten ist, und es wurde offensichtlich von der MS-Analyse nach S-Carboxamidomethylation. Es ist das erste Mal, das ein Protein im Amami-Ōshima s. Flavoviridis Gift in Tokunoshima P. Flavoviridis Gift nicht gefunden wird.
BosR (BB0647) Regelt Die Virulenz Ausdruck in Borrelia Burgdorferi
Zusammenfassung Borrelia Burgdorferi (Bb), die Lyme-Borreliose Spirochäten, codiert eine potenzielle ferric Aufnahme Regler (Fur) Homolog, BosR (BB0647). So weit, eine Rolle für BosR in Bb-Stoffwechsel, Genregulation oder Pathogenese nicht festgestellt wurde, weitgehend aufgrund der bisher Unfähigkeit, BosR in niedrig-Passage, infektiöse Bb-Isolate zu inaktivieren. Hier berichten wir die Generierung der ersten BosR-defizienten Mutant in einem virulenten Stamm von Bb., während der BosR-Mutant normalerweise in Zecken beibehalten, der Mutant konnte infizieren Mäuse, für Bb-Infektion eines Säugetier-Hosts BosR hinweist. Darüber hinaus zeigte transkriptionelle Profilierung von der BosR-Mutant, dass eine Reihe von Genen, die entweder positiv oder negativ, durch BosR-Mangel beeinflusst wurden, darauf hindeutet, dass BosR funktioniert sowohl als globale Verdränger und Aktivator in Bb. auffallend, unsere Studie zeigte, dass BosR steuert den Ausdruck von zwei großen Virulenz-assoziierte Bb Lipoproteinen, OspC und DbpA, wahrscheinlich über einen Einfluss auf die alternative Sigma-FaktorRPO. Diese Studie so hat nicht nur einen anderen Schlüssel Virulenz-gen von Bb aufgeklärt, sondern bietet auch neue Einblicke in eine bisher unbekannte Ebene der Genregulation EZB RpoS in Bb.
Charakterisierung Von Einzigartigen Regionen Von Borrelia Burgdorferi Oberfläche Gelegenen Membranprotein 1
Der Erreger der Lyme-Borreliose, Borrelia Burgdorferi, produziert ein mutmaßliches Oberfläche Protein, genannt "Oberfläche gelegene Membranprotein 1" (Lmp1). Lmp1 hat zuvor gezeigt, die Mikrobe in Umgehung der Host erworbenen Immunabwehr und bei der Festlegung der anhaltende Infektionen der Säugetiere zu unterstützen. Hier zeigen wir, dass Lmp1 eine integrale Membranprotein mit Oberfläche exponierten N-Terminal, mittlere und C-terminalen Regionen ist. Während der murinen Infektion wurden Antikörper erkennen diese drei Protein-Regionen hergestellt. Separate Immunisierung von Mäusen mit diskreten Regionen ausgeübt Wirkungen auf das Spirochete überleben während der Infektion. Insbesondere behinderten Antikörper gegen die C-terminalen Region hauptsächlich B. Burgdorferi Persistenz in den Gelenken, während Antikörper, die spezifisch für die N-terminalen Region überwiegend Pathogen Ebenen im Herzen, einschließlich der Entwicklung von Karditis betroffen. Genetische Rekonstitution der lmp1-Löschung-Mutanten mit der lmp1 N-terminalen Region erheblich verbessert seine Fähigkeit, die bakterizide Effekte immun Seren zu widerstehen und auch wurde beobachtet, um Erreger überleben in-vivo zu erhöhen. Zusammengenommen zufolge die zusammengefassten Daten die N-terminalen Region Lmp1 spielt eine wichtige Rolle für Spirochete überleben und andere Teile des Proteins beziehen sich auf bestimmte Funktionen, Pathogen Persistenz und Tropismus entspricht, während der Infektion, die organspezifischen Weise angezeigt wird. Die hier berichteten Ergebnisse unterstreichen die Tatsache, die dass Oberfläche exponierten Regionen der Lmp1 potenziell dienen könnte, als Impfstoff Ziele oder Antigene Regionen, die den Verlauf der natürlichen Lyme-Borreliose verändern könnte.
Antikörper Profilerstellung Von Borrelia Burgdorferi-Infektion Bei Pferden
Infektion mit Borrelia Burgdorferi ist bei Pferden und Ponys aus den Neuengland und Mittelatlantik Regionen der Vereinigten Staaten verbreitet. Hier, werteten wir Luciferase-Immunopräzipitation-Systeme (LIPS) für die Profilerstellung Antikörperantworten gegen drei verschiedene Antigene Ziele für die Diagnose von Equiden B. Burgdorferi-Infektion. Lippen Testen von Pferd Serumproben Verdacht Lyme Infektion ergab, dass rund 75 % der Proben Pferd (114/159) seropositiv gegen das synthetische VOVO-Antigen, bestehend aus wiederholten immundominante C6 Epitopes sowie OspC immundominante Epitope. Ein Vergleich von VOVO und Immunfluoreszenz-Assays (IFA) zeigte, dass 51 % der Proben in beiden Tests positiv waren (VOVO(+)/IFA(+)), waren VOVO(-)/IFA(+) 13 %, 21 % waren VOVO(+)/IFA(-) und 15 % in beide negativ waren. Um weitere humorale Reaktionen auf B. Burgdorferi zu verstehen und die diagnostische Unterschiede zwischen IFA und VOVO, wurden zwei zusätzliche B. Burgdorferi-Lippen-Tests durchgeführt, mit DbpA und DbpB. Robust seropositiven Antikörperantworten gegen DbpA bzw. DbpB in 98 % (79/81) von den VOVO(+)/IFA(+) und 93 % (50/54) abweichende Beispiele wurden erkannt. Darüber hinaus einige der negativen Proben von VOVO und IFA zeigte Immunoreactivity gegen DbpA bzw. DbpB. insgesamt 94 % der vermuteten Pferd Proben wurden von LIPS seropositiven und Hitze Karte Analyse ergab, dass seropositiven Proben oft mit mindestens zwei der drei Antigene sind waren. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Lippen Prüfungen beschäftigt mehrere rekombinante Antigene einen vielversprechenden Ansatz für die Bewertung von Antikörperantworten in der Lyme Krankheit anbieten.
Charakterisierung Von Multiprotein Komplexe Von Borrelia Burgdorferi Außenmembran Vesikeln
Unter den bakteriellen Zelle Umschläge ist die Borrelia Burgdorferi äußere Membran (OM) strukturell einzigartig, da die Identität von vielen Proteinkomplexen unbekannt bleiben; Ihre Charakterisierung ist jedoch der erste Schritt zu unserem Verständnis von Membran-Protein-Interaktionen und mögliche Funktionen. Hier verwendet wir zweidimensionale blau Native/SDS-PAGE/Mass spektrometrischen Analyse für eine globale Charakterisierung von Protein-Protein Interaktionen als auch hinsichtlich der Proteinkomplexe in OM Bläschen aus mehreren infektiöse Sensu Stricto Isolaten von B. Burgdorferi isoliert zu identifizieren. Obwohl wir die Existenz von mindestens 10 unterschiedliche OM-komplexe beherbergen mehrere einzigartige Untereinheiten entdeckt, wird die Complexome durch das häufige Auftreten der eine begrenzte Vielfalt von Membranproteinen, vor allem P13, äußere Oberfläche Protein (Osp) A, -B, - C, und -D und Lp6.6 dominiert. Das Vorkommen dieser komplexe und Spezifität der Untereinheit Interaktion wurden weiter unterstützt, durch unabhängige zweidimensionalen Immunoblotting und Coimmunoprecipitation-Assays sowie Mutagenese Studien, wo gezielte Dezimierung der Mitglied Untereinheit (P66) gezielt eine bestimmte komplexe abgeschafft. Eine vergleichbare Profil der OM-Complexome in zwei großen infektiösen Isolaten, wie B31 und 297, erkannt wurde zwar bestimmte komplexe Isolat-spezifische Weise auftreten. Weitere Beurteilung von Proteinkomplexen in mehreren Osp-defizienten Isolate Verlust von mehreren Proteinkomplexe aber offenbart die Existenz von zusätzlichen Komplex/Untereinheiten, die in Wildtyp Zellen nicht nachweisbar sind. Zusammen, deckte diese Beobachtungen borrelial Antigene Membran-Protein-Interaktionen beteiligt. Die Studie schlägt auch, dass der Bestückung der OM komplexe spezifische und komplexe die Core oder Stabilisierung Untereinheiten unterscheiden. Weitere Charakterisierung dieser Protein-komplexe, die Aufschluß über ihre biologische Bedeutung kann neue Aufschluss über den Mechanismus der Persistenz der Erreger und die Entwicklung präventiver Maßnahmen gegen die Infektion.
Die Coenzym A-Disulfid-Reduktase Von Borrelia Burgdorferi Ist Für Schnelles Wachstum Während Der Enzootischen Zyklus Wichtig Und Notwendig Für Infektion Des Säugetier-Hosts
In einer Microarray-Analyse von der RPO-Regulon in Säugetieren Host angepasst Borrelia Burgdorferi, bb0728 (cdr) doppelt sein transkribiert durch die Sigma-Faktoren, σ(70) und RpoS gefunden wurde. Das cdr-Gen codiert ein Coenzym A Disulfid-Reduktase (CoADR), die CoA-Disulphides, CoA NADH-abhängigen Weise reduziert. Auf der Grundlage der Fülle von CoA in B. Burgdorferi und die Biochemie des Enzyms, wurde CoADR vorgeschlagen, eine Rolle in der Spirochäten Reaktion auf reaktive Sauerstoffspezies. Zum besseren Verständnis der physiologischen Funktion des BbCoADR (en) erzielten wir eine B. Burgdorferi-Mutante, in der das cdr-Gen gestört wurde. RT-PCR und 5'-RACE-Analyse ergab, dass cdr und bb0729 aus einer transkriptionelle Einzelstart stromaufwärts die kodierende Sequenz von bb0729 co-transcribed sind; ein Shuttle-Vektor mit den bb0729-cdr-Operon und upstream Promotor-Element wurde verwendet, um den cdr-Mutanten zu ergänzen. Obwohl der Mutant nicht empfindlicher auf Wasserstoffperoxid als übergeordneten war, es erhöhten Empfindlichkeit gegenüber hohen Konzentrationen von t-Butyl-Cumolhydroperoxid, eine oxidierende Substanz aufweisen, die spirochetal Membranen schädigt. Charakterisierung der Mutant während Standard (15 % Sauerstoff, 6 % CO(2)) und anaerobe (< 1 % O(2), 9-13 % CO(2)) Anbau bei 37 ° C ergab einen Defekt Wachstum unter beiden Bedingungen, die während Anaerobiosis auffällig war. Der Mutant war avirulent von Nadel-Inokulation und zeigte verminderte Überleben in der Fütterung Nymphen, aber kein überleben-Mangel in ungespeist flache Nymphen angezeigt. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse schlagen wir vor, BbCoADR optimale Redox-Verhältnisse für CoA/CoA-Disulfit und NAD(+) /NADH in Zeiten der raschen Replikation während der enzootischen Zyklus, Thiol-Disulfid-Homöostase zu unterstützen und indirekt die Spirochäten gegen Peroxid-vermittelte Membrane Beschädigung zu schützen beibehalten werden muss; eine oder mehrere dieser Funktionen sind unerlässlich für die Säugetier-Host von B. Burgdorferi-Infektion.
Borrelien BBA52 Ist Ein Potenzielles Ziel Für Die Übermittlung, Die Sperrung Der Lyme-Borreliose-Impfstoff
Die Oberfläche exponierten Antigene der Borrelia Burgdorferi stellen wichtige Ziele für die Induktion von schützenden Host Immunantworten dar. BBA52 wird bevorzugt durch B. Burgdorferi in der Fütterung Tick ausgedrückt, und eine gezielte Löschung von bba52 beeinträchtigt Vektor-Host Übergänge in-vivo. In dieser Studie demonstriert, dass BBA52 eine äußere Oberfläche exponierten Membranprotein und Disulfidbrücken der Homo-Oligomere Versammlung des nativen Protein teilzunehmen. BBA52 Antikörper fehlen nachweisbare Borreliacidal Aktivitäten in-vitro. Jedoch zeigten aktive Immunisierung Studien, dass BBA52 geimpft Mäuse deutlich weniger anfällig für nachfolgende Tick-Borne Herausforderung Infektion waren. In ähnlicher Weise blockiert passiven Übertragung von BBA52 Antikörpern in Zecken komplett B. Burgdorferi-Übertragung von Zecken auf naive Mäuse Fütterung. Zusammen genommen diese Studien unterstreichen die Rolle des BBA52 in Spirochete Verbreitung von Zecken auf Mäuse und zeigen das Potenzial der BBA52 antikörpervermittelten Strategie ergänzt die laufenden Bemühungen, Impfstoffe für blockiert die Übertragung von B. Burgdorferi zu entwickeln.
