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Articles by Tove Alm in JoVE
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由一个小型的双特异性亲和标签的推动正交蛋白质纯化
School of Biotechnology, Department of Proteomics, Royal Institute of Technology
已开发一种新的和高效两步亲和层析协议，并进行了详细描述。该方法是基于一个小净化标签有两个固有的亲和力，适用于广泛的目标蛋白质具有不同的属性。
Other articles by Tove Alm on PubMed
单步执行恢复和使用阳离子分离纯化标记的包涵体蛋白固相复性。
描述了包涵体形成的蛋白质的分离纯化的战略，在其中的正电荷的域 Z(basic) 用于作为融合伙伴捕获的变性蛋白质在阳离子交换柱。它表明纯标记选择性变性的条件下。此外，与他 (6) 的分离纯化的常用方法比较纯化蛋白包涵体的新战略-包涵体蛋白标记。最后，目标蛋白捕获的 Z(basic) 标记所提供的简单而有效的手段是进一步成功探索固相复性。此过程结合纯化和复性在一个步骤中的继承优点和洗脱浓缩的产品适合缓冲区中的优点。
阳离子交换色谱的使用 Denaturating 条件下的高吞吐量蛋白纯化。
制定了一种使用 Z(basic) 标记阳离子的高通量蛋白质纯化战略。为了使有用的战略既为可溶性和不可溶性蛋白、 denaturating 剂、 尿素、 中使用了所有的纯化步骤。第一，蛋白质基因电熔于纯化标签，Z(basic) 的四个目标。这些蛋白质构造，净化阳离子交换色谱法和洗脱用盐的渐变。取得的数据，从纯化战略计划包括阶段洗脱，使平行蛋白纯化使用实验室机器人。一种协议，一切都不需要任何体力处理操作的步骤，包括所有步骤、 色谱法树脂的均衡、 示例、 洗净，和洗脱，负载是由实验室机器人处理。该程序允许自动的净化给毫克到 60 细胞裂解，纯重组蛋白的量。在此研究 22 不同蛋白质实验室机器人成功纯化构造，pI 和溶解度，关于不同特色。数据显示 Z(basic) 可以用作一般纯标签 denaturating 条件下也。此外，该战略使不同 pI 和溶解度使用离子交换色谱法 (IEXC) 与蛋白质的分离纯化。该过程是高度可重现和允许高蛋白质产量和纯度，因此良好补充到常用他 6 标记。
选定的正交亲和纯化的小双特异性蛋白。
通过随机抽取和选择已创建了双重亲和与新型蛋白域。小碱稳定白蛋白结合域 (ABD *)，作为支架用于构造库中，有亲和力的人血清白蛋白 (HSA) 和 46 11 被随机其中的氨基酸的组成。为了实现双活页夹，固有的 HSA 亲和力的绑定站点没有动和随机选择了另一侧的分子。尽管它的体积小和几乎四分之一的其氨基酸双官能团的分子，随机化 ABDz1，将绑定到磁头和 Z2 域蛋白 A 的能力与成功入选使用噬菌体展示。此外，新选定的备选案文表明改进亲和贮氢合金电极相比父母的分子。关于向两个不同配体的亲和二级结构的特点是这种新型蛋白质域。在两个不同矩阵上亲和纯化的可能性已使用两个配体、 HSA 矩阵和蛋白质进行调查基于 A 矩阵 MabSelect 当然，域和新蛋白纯净的同质性。此外，新的域和具有不同特点的三个不同的目标蛋白质之间的基因融合了。为了充分利用这两种亲缘关系，创建了称为使用两个不同矩阵的正交亲和纯化分离纯化战略。所有三个版本的成功分离纯化高效地进行使用此策略。
工程双到单个域中白蛋白结合。
双特异性抗体，以及非免疫球蛋白基于双特异性亲和蛋白质被认为具有很高的潜在未来中应用。在这项研究，我们报告一种新方法极小双特异性蛋白组成的仅有一个结构域的一代。绑定到肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 到白蛋白绑定域工程同时仍保留原始亲和力为白蛋白，从而导致双特异性蛋白组成的只是 46 氨基酸。非白蛋白绑定一侧的三螺旋束域名，，然后显示结果库对噬菌体颗粒，多样化的双特异性单结构域蛋白质是孤立使用与肿瘤坏死因子-α 的选择作为目标。此外，基于从噬菌体选择获得序列，第二代库旨在为进一步增加亲和力的双特异性候选人。金黄色葡萄球菌表面显示被雇用的亲和力成熟，作为在同一选择目标周期使改进联编程序，以及基于多参数的排序情况与肿瘤坏死因子-α 和白蛋白的高效分离。孤立的变种被测序和分析的白蛋白和肿瘤坏死因子-α 的绑定了。这种分析揭示肿瘤坏死因子-α 的亲和性，低于 5 nM 的最强的粘合剂。从多参数进行排序同时有针对性的肿瘤坏死因子-α 和白蛋白，几双特异性候选人孤立这两个抗原的高亲和力，表明该单元格显示荧光激活细胞分选的结合是双工程适用技术。就我们所知，新联编程序代表报告到目前为止的最小工程双特异性蛋白质。讨论可能性和挑战，以及这种新型战略的潜在未来的应用程序。
