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Articles by Tove Alm in JoVE
JoVE General
Protein Purification Orthogonal Animé par une étiquette d'affinité bispécifiques petits
School of Biotechnology, Department of Proteomics, Royal Institute of Technology
Un roman et très efficace en deux étapes chromatographie d'affinité protocole a été élaboré et est décrite en détail. La méthode est basée sur une petite étiquette de purification avec deux affinités inhérentes et est applicable à un large éventail de protéines cibles avec des propriétés différentes.
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Une Seule étape Et En Phase Solide Repliement De Protéines De L'organisme D'inclusion En Utilisant Une étiquette De Purification Polycationique
Une stratégie pour la purification d'inclusion corps formant protéines est décrite, dans lequel le domaine à charge positive Z (base) est utilisé en tant que partenaire de fusion pour la capture de protéines dénaturées sur une colonne échangeuse de cations. Il est montré que l'étiquette de purification est sélective dans des conditions dénaturantes. En outre, la nouvelle stratégie pour la purification de protéines à partir de corps d'inclusion est comparée à la méthode couramment utilisée pour la purification de ses (6)-protéines marquées corps d'inclusion. Enfin, les moyens simples et efficaces de protéine cible capturer fournie par le Z (de base) tag est encore exploré avec succès en phase solide pour le repliement. Cette procédure présente l'avantage de combiner hérité de purification et de repliement en une seule étape et offre l'avantage d'élution du produit concentré dans un tampon approprié.
Purification Des Protéines à Haut Débit Dans Des Conditions Dénaturantes Par L'utilisation De Chromatographie Par échange Cationique
Une stratégie à haut débit utilisant la purification des protéines recombinantes polycationique Z (de base) tag a été développé. Pour que la stratégie visant à être utile à la fois pour les protéines solubles et moins soluble, un agent dénaturant, l'urée, a été utilisé dans toutes les étapes de purification. Tout d'abord, quatre protéines cibles ont été génétiquement fusionné à la balise de purification, Z (de base). Ces constructions de protéines ont été purifiées par chromatographie d'échange cationique et éluée en utilisant un gradient de sel. A partir des données obtenues, une stratégie de purification a été planifié, y compris élution par étapes pour permettre la purification des protéines parallèle en utilisant un robot de laboratoire. Un protocole qui comprend toutes les étapes, équilibration de la résine de chromatographie, la charge de l'échantillon, les laver et d'élution, le tout sans aucune mesure de manutention manuelle, a été traitée par le robot de laboratoire. Le programme permet la purification automatisé donnant milligrammes de protéine recombinante pure de jusqu'à 60 lysats cellulaires. Dans cette étude 22 constructions de protéines différentes, avec des caractéristiques différentes concernant les pI et la solubilité, ont été avec succès purifié par le robot de laboratoire. Les données montrent que Z (de base) peut être utilisé comme une étiquette de purification générale a également dans des conditions dénaturantes. En outre, la stratégie permet la purification des protéines de pI différent et la solubilité en utilisant chromatographie échangeuse d'ions (Iexc). La procédure est très reproductible et permet pour le rendement à haute valeur protéique et de la pureté et est donc un bon complément à l'couramment utilisés Son (6)-tag.
Une Petite Protéine Bispécifique Sélectionné Pour Purification Par Affinité Orthogonale
Une nouvelle protéine de domaine avec une affinité double a été créé par la randomisation et la sélection. Le petit alcali-albumine stabilisé domaine de liaison (ABD *), utilisé comme échafaudage pour construire la bibliothèque, possède une affinité pour l'albumine sérique humaine (HSA) et est constitué de 46 acides aminés dont 11 ont été randomisés. Pour atteindre un liant double, le site de liaison de l'affinité inhérente SAH a été touché et le randomisation est faite sur le côté opposé de la molécule. Malgré sa petite taille et la randomisation de près d'un quart de ses acides aminés, une molécule bifonctionnelle, ABDz1, avec la capacité de se lier à la fois HSA et le domaine Z2 / protéine A a été sélectionné à l'aide avec succès phage display. En outre, le variant nouvellement sélectionné montré affinité améliorée de la SAH par rapport à la molécule parentale. Ce domaine nouvelle protéine a été caractérisée en ce qui concerne la structure secondaire et de l'affinité pour les deux ligands différents. La possibilité pour la purification d'affinité sur deux matrices différentes a été étudiée en utilisant les deux ligands, la matrice HSA et la protéine A-base, la matrice MabSelect sûr, et le domaine de la protéine nouvelle a été purifiée jusqu'à homogénéité. En outre, des fusions de gènes entre le nouveau domaine et trois protéines cibles différentes avec des caractéristiques différentes ont été faites. Pour profiter de ces deux affinités, une stratégie de purification appelé la purification par affinité orthogonale en utilisant deux matrices différentes a été créé. Purification réussie de tous les trois versions a été efficacement réalisée en utilisant cette stratégie.
Bispecificity Génie Dans Un Unique Liant L'albumine De Domaine
Des anticorps bispécifiques ainsi que non-immunoglobulines à base de protéines d'affinité bispécifiques sont considérés comme ayant un très fort potentiel dans les futures applications biothérapeutiques. Dans cette étude, nous présentons une nouvelle approche pour la génération de très petites protéines bispécifiques comprenant un seul domaine structurel. La liaison à facteur de nécrose tumorale α-(TNF-α) a été conçu dans un domaine liant l'albumine, tout en conservant l'affinité pour l'albumine d'origine, résultant en une protéine composée de seulement bispécifique 46 acides aminés. Par la diversification de la non liant l'albumine côté du domaine faisceau de trois hélices, suivie par l'affichage de la bibliothèque en résulte sur les particules de phage, bispécifiques à domaine unique protéines ont été isolées à l'aide des sélections avec le TNF-α comme cible. En outre, sur la base des séquences obtenues à partir de la sélection du phage, une bibliothèque de deuxième génération a été conçu en outre pour augmenter l'affinité des candidats bispécifiques. La surface d'affichage staphylococcique a été employé pour la maturation d'affinité, permettant d'isoler efficacement liants améliorés ainsi que multiparamétrique à base de tris à la fois avec le TNF-α et de l'albumine comme cibles dans le cycle de sélection même. Variantes isolées ont été séquencés et la liaison à l'albumine et de TNF-α a été analysée. Cette analyse a révélé une affinité pour le TNF-α en dessous de 5 nM pour les plus forts liants. De la multiparamétrique de tri qui, simultanément, le TNF-α ciblé et de l'albumine, plusieurs candidats ont été isolés bispécifiques avec une forte affinité pour les deux antigènes, ce qui suggère que la cellule d'affichage en combinaison avec le tri des cellules activé par fluorescence est une technologie appropriée pour l'ingénierie des bispecificity. À notre connaissance, les nouveaux liants représentent les plus petites d'ingénierie des protéines bispécifiques signalés jusqu'à présent. Les possibilités et les défis ainsi que les applications futures potentielles de cette nouvelle stratégie sont discutés.
