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Articles by Tove Alm in JoVE
JoVE General
Orthogonal Protein Purification von einer kleinen Bispezifische Affinity Tag Facilitated
School of Biotechnology, Department of Proteomics, Royal Institute of Technology
Eine neuartige und hocheffiziente Zwei-Schritt-Affinitätschromatographie-Protokoll wurde entwickelt und wird im Detail beschrieben. Die Methode basiert auf einer kleinen Reinigung tag mit zwei inhärenten Affinität und ist für eine breite Palette von Target-Proteinen mit unterschiedlichen Eigenschaften.
Other articles by Tove Alm on PubMed
Recovery in Einem Schritt Und Festphasen-Rückfaltung Einschlusskörper Proteine Mit Einen Polycationic-Reinigung-Tag
Eine Strategie für die Reinigung der Einschlusskörper-bildende Proteine wird beschrieben, in dem die positiv geladene Domäne Z(basic) als Fusion Partner für die Erfassung der denaturierten Proteine auf ein Kat-Spalte verwendet wird. Es wird gezeigt, dass das Reinigung-Tag unter Denaturierung Bedingungen selektiv. Darüber hinaus ist die neue Strategie für die Aufreinigung von Proteinen aus Einschlusskörperchen gegenüber der häufig verwendete Methode zur Reinigung von seinem (6)-Einschlusskörper Proteine markiert. Schließlich ist die einfache und effektive Mittel Ziel Protein Capture bereitgestellt durch das Z(basic)-Tag weiter erfolgreich für Festphasen-Rückfaltung untersucht. Dieses Verfahren hat den geerbten Vorteil der Kombination von Reinigung und Rückfaltung in einem Schritt und bietet den Vorteil der eluting Konzentrat in einem geeigneten Puffer.
Hochdurchsatz Proteinreinigung Unter Denaturating Bedingungen Durch Den Einsatz Von Kat-Chromatographie
Eine Hochdurchsatz-Protein-Reinigung-Strategie mit der Polycationic Z(basic) Tag wurde entwickelt. Damit die Strategie, nützlich zu sein sowohl für lösliche und weniger löslichen Proteine, Denaturating Agent, Harnstoff, wurde verwendet bei allen Schritten der Reinigung. Erstens, vier Ziel-Proteine genetisch dem Reinigung-Tag, Z(basic) verschmolzen wurden. Diese Protein-Konstrukte wurden durch Kat-Chromatographie gereinigt und mit einem Salzen Farbverlauf eluiert. Aus den Daten erreicht war eine Reinigung-Strategie geplant, einschließlich schrittweise Elution um parallele Proteinreinigung mit einen Labor-Roboter zu aktivieren. Ein Protokoll, das umfasst alle Schritte, Auswuchten der Chromatographie-Harz, Belastung der Probe, Waschen und Elution, alles ohne jede Anleitung Umgang mit Schritten, wurde vom Labor Roboter behandelt. Das Programm erlaubt die automatisierte Reinigung Milligramm-Mengen von reinen rekombinantes Protein von bis zu 60 Zelllysate geben. In dieser Studie 22 verschiedenen Protein waren Konstrukte, mit unterschiedlichen Eigenschaften bezüglich pI und Löslichkeit, erfolgreich vom Labor Roboter gereinigt. Die Daten zeigen, dass Z(basic) als allgemeine Reinigung Tag auch unter Denaturating Bedingungen verwendet werden können. Darüber hinaus ermöglicht die Strategie Aufreinigung von Proteinen mit verschiedenen pI und Löslichkeit mit Ionenaustauschchromatographie (IEXC). Das Verfahren ist sehr reproduzierbar und ermöglicht hohen Protein-Ausbeute und Reinheit und ist daher eine gute Ergänzung zu den häufig verwendeten seine 6-Tag.
Eine Kleine Bispezifischer-Protein Für Orthogonale Affinitätsreinigung Ausgewählt
Eine neuartige Protein-Domäne mit dual Affinität wurde durch Randomisierung und Auswahl erstellt. Die kleine Alkali stabilisierten Albumin-bindende Domäne (ABD *), als Gerüst verwendet, um die Bibliothek zu konstruieren hat Affinität zum menschlichen Serum-Albumin (HSA) und konstituiert sich aus 46 Aminosäuren, von denen 11 randomisiert wurden. Um eine duale-Sammelmappe zu erreichen, wurde die Bindungsstelle der inhärenten HSA-Affinität unberührt und die Randomisierung wurde auf der gegenüberliegenden Seite des Moleküls. Trotz seiner geringen Größe und Randomisierung von fast ein Viertel seiner Aminosäuren, ein Bifunktionelles Molekül, ABDz1, mit Möglichkeit zum Binden an HSA und Z2 Domäne/Protein A erfolgreich wählte Phagen-Display verwenden. Darüber hinaus zeigte die neu ausgewählte Variante verbesserte Affinität für HSA im Vergleich zu den elterlichen Molekül. Diese neuartige Protein-Domäne war bezüglich Sekundärstruktur und Affinität zu zwei unterschiedlichen Liganden charakterisiert. Die Möglichkeit der Affinitätsreinigung auf zwei verschiedenen Matrizen wurde untersucht mit zwei Liganden, der HSA-Matrix und das Protein A-basierte, MabSelect SuRe Matrix und die neue Proteindomäne zur Homogenität gereinigt wurde. Darüber hinaus erfolgten gen Fusionen zwischen der neuen Domäne und drei unterschiedliche Ziel-Proteine mit unterschiedlichen Eigenschaften. Um beide Affinitäten zu nutzen, entstand eine Reinigung-Strategie als orthogonale Affinitätsreinigung mit zwei verschiedene Matrizen bezeichnet. Erfolgreiche Reinigung aller drei Versionen wurde effizient durchgeführt, mit dieser Strategie.
Ingenieur-Bispecificity in Eine Einzige Domäne Albumin-Bindung
Bispezifischer Antikörper als auch nicht-Immunglobulin basierend Bispezifischer Affinität Proteine werden als eine sehr hohe künftig biotherapeutische Anwendungsmöglichkeiten haben. In dieser Studie berichten wir über einen neuen Ansatz zur Generierung von extrem kleinen Bispezifischer Proteine bestehen aus nur einer einzigen strukturellen Domäne. Bindung an Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) wurde in eine Domäne im Eiweiß-Bindung entwickelt, während noch die Beibehaltung der ursprünglichen Affinität für Albumin, wodurch ein Bispezifischer Protein setzt sich aus lediglich 46 Aminosäuren. Durch Diversifikation der unverbindlichen Albumin-Seite des drei-Helix-Bündel Domäne, gefolgt vom Display der resultierende Bibliothek auf Bakteriophagenpartikel wurden Bispezifischer einzelnen Domäne Proteine isoliert mit Auswahlen mit TNF-α als Ziel. Darüber hinaus wurde auf der Grundlage der erhaltenen Sequenzen aus der Phage-Auswahl, eine zweite Generation Bibliothek entworfen um die Affinität der Bispezifischer Kandidaten zu steigern. Staphylokokken Oberfläche Display war für die Affinität-Reifung, ermöglicht effiziente Isolierung verbesserte Bindemittel sowie Multiparameter-basierte Sortings mit TNF-α und Albumin als Ziele in der gleichen Auswahl Zyklus beschäftigt. Isolierte Varianten wurden sequenziert und die Bindung an Albumin und TNF-α wurde analysiert. Diese Analyse ergab eine Affinität für TNF-α unter 5 nM für die stärkste Bindemittel. Aus der Multiparameter sortieren, dass mehrere Bispezifischer Kandidaten gleichzeitig gezielte TNF-α und Albumin, isoliert mit hoher Affinität zu beide Antigene waren, was darauf hindeutet, dass Zelle ist Display in Kombination mit Fluoreszenz aktivierten Zellsortierung eine geeignete Technologie für Engineering von Bispecificity. Unseres Wissens darstellen der neuen Bindemittel die kleinste veränderter Bispezifischer Proteine wurden bisher beschrieben. Möglichkeiten und Herausforderungen sowie mögliche zukünftige Anwendungen dieser neuartige Strategie werden diskutiert.
