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Articles by Tove Alm in JoVE
JoVE General
작은 Bispecific 선호도 태그에 의해 용이 직교 단백질 정제
School of Biotechnology, Department of Proteomics, Royal Institute of Technology
소설과 고효율 두 단계 친화도 크로마 토그래피 프로토콜이 개발되었고 자세하게 설명되어 있습니다. 방법은 두 개의 본질적 동질성과 작은 정화 태그를 기반으로하고 다른 특성을 가진 대상 단백질의 다양한 적용됩니다.
Other articles by Tove Alm on PubMed
단일 단계 복구 및 고체 상 Refolding Polycationic 정화 태그를 사용 하 여 포함 신체 단백질의
양이온 교환 칼럼에 변성된 단백질의 캡처에 대 한 긍정적으로 충전된 도메인 Z(basic) 융합 파트너로 사용 되 포함 바디 형성 단백질의 정화에 대 한 전략을 설명 합니다. 그것은 정화 태그 변성 조건에서 선택 표시 됩니다. 그의 (6)의 정화에 대 한 일반적으로 사용 되는 메서드로 포함 시체에서 단백질의 정화에 대 한 새로운 전략 비교 또한,-태그 포함 신체 단백질. 마지막으로, Z(basic) 태그에서 제공 하는 대상 단백질 캡처의 간단 하 고 효과적인 수단 성공적으로 고체 상 refolding에 대 한 탐구를 추가 된다. 이 이렇게 정화를 결합 하 고 한 단계에서 refolding 상속 된 이용, eluting 적당 한 버퍼에 집중 되어 제품의 이점을 제공 합니다.
양이온 교환 크로마토그래피의 사용에 의해 Denaturating 조건 하에서 높은 처리량 단백질 정화
높은 처리량 단백질 정화 전략 polycationic Z(basic) 태그를 사용 하 여 개발 되었습니다. 유용한 전략에서 용 해 하 고 덜 수용 성 단백질, denaturating 에이전트, 우 레 아, 둘 다 모든 정화 단계에 사용 되었다. 첫째, 4 개의 대상 단백질 정화 태그 Z(basic) 융합 유전자 조작 했다. 이러한 단백질 구조 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정화 되었다 고 eluted 소금 그라데이션을 사용 하 여. 달성 하는 데이터에서 정화 전략 연구소 로봇을 사용 하 여 병렬 단백질 정화 수 있도록 stepwise 차입을 포함 하 여 계획 되었다. 프로토콜 처리 단계, 어떤 매뉴얼 없이 모든 단계, 크로마토그래피 수 지의 평형, 샘플, 세척, 차입의 부하를 포함 하는 실험실 로봇에 의해 처리 되었습니다. 프로그램 자동된 정화를 60 셀 lysates 최대의 순수한 재조합 단백질의 양을 밀리 그램을 주는 수 있습니다. 연구 22 다른 단백질이 구문 pI 및 용 해도, 다른 특성을 가진 실험실 로봇에 의해 정화 성공적으로 했다. 데이터 표시 Z(basic) denaturating 조건 또한 일반적인 정화 태그로 사용할 수 있습니다. 또한, 전략 다른 Pi와 이온 교환 크로마토그래피 (IEXC)를 사용 하 여 용 해도 단백질 정화 수 있습니다. 절차는 높은 재현성 및 높은 단백질 수율 및 순도 대 한 수 고는 그러므로 그의 (6)-태그를 자주 사용 하는 좋은 보완.
직교 친 화력 정화에 대 한 선정 작은 Bispecific 단백질
이중 선호도 소설 단백질 도메인 랜덤 및 선택에 의해 생성 되었습니다. 작은 알칼리 안정화 알 부 민 바인딩 도메인 (ABD *) 비 계로 라이브러리를 만드는 데 사용 선호도 인간 혈 청 알 부 민 (HSA)를 있으며 11 무작위로 했다는 46 아미노산의 구성. 듀얼 바인더를 달성 하기 위해 고유의 HSA 선호도의 바인딩 사이트 감동 했다와 랜덤 분자의 반대편에 만들어졌다. 그것의 작은 크기와 랜덤 bifunctional 분자의 아미노산의 거의 4 분의에 불구 하 고 ABDz1, HSA와 Z2 도메인/단백질 A 모두에 바인딩할 수 있게 된는 성공적으로 선택 살 균 소 디스플레이 사용 하 여. 또한, 새로 선택한 변형 부모의 분자에 비해 HSA에 대 한 향상 된 선호도 보였다. 이 비 발한 단백질 도메인 2 차 구조와 두 개의 서로 다른 ligands 선호도 관한 특징 되었습니다. 두 개의 ligands, HSA 매트릭스 단백질을 사용 하 여 두 개의 다른 매트릭스에 친 화력 정화를 위한 가능성 조사 되었습니다 A 기반 MabSelect 물론 행렬과 새로운 단백질 도메인 동질성을 정화 했다. 또한, 새 도메인 및 다른 특성을 가진 3 개의 다른 대상 단백질 사이의 유전자 fusions 되었다. 두 동질성을 활용 하려면 두 다른 매트릭스를 사용 하 여 직각 친 화력 정화 라고 정화 전략을 만들었습니다. 모든 세 가지 버전의 성공적인 정화가이 전략을 사용 하 여 효율적으로 수행 되었다.
단일 알 부 민 바인딩 도메인으로 공학 Bispecificity
Bispecific 항 체로 면역 글로불린 비 기반된 bispecific 선호도 단백질 매우 높은 잠재적인 미래에 biotherapeutic 응용 프로그램 것으로 간주 됩니다. 이 연구에서 우리가 구조 도메인만 이루어진 매우 작은 bispecific 단백질의 생성에 대 한 새로운 접근 방식을 보고. 종양 괴 사 인자-α (TNF-α)를 바인딩 알 부 민에 대 한 원래 선호도 유지 하면서 알 부 민 바인딩 도메인으로 설계 된, 결과 bispecific에 단지 46 단백질 구성 아미노산. 살 균 소 입자에 결과 라이브러리의 표시 이어서 3 나선 번들 도메인의 구속력이 알 부 민 쪽의 다양화에 의해 bispecific 단일 도메인 단백질 TNF-α와 함께 선택 영역을 사용 하 여 대상으로 고립 되었다. 또한, 살 균 소 선택에서 얻은 순서에 따라 2 세대 라이브러리 bispecific 후보자의 선호도 더욱 높이기 위해 설계 되었습니다. 포도 표면 디스플레이 같은 선택의 대상 사이클 TNF-α와 알 부 민 sortings multiparameter을 기반으로 향상 된 바인더의 효율적인 분리 가능 하 게 하는 선호도 성숙에 대 한 고용 했다. 격리 된 변형 된 시퀀싱 하 고 알 부 민 및 TNF-α를 바인딩 분석 했다. 이 분석 5 TNF-α에 대 한 선호도 밝혀 강한 바인더에 대 한 뉴 멕시코. 동시에 타겟된 TNF-α 및 알 부 민, 여러 bispecific 후보 두 항 원에 높은 선호도와 고립 되었다 정렬, 그 셀을 제안 하는 multiparameter에서 활성화 형광 세포 분류와 함께에서 디스플레이 bispecificity의 엔지니어링에 대 한 적합 한 기술입니다. 우리의 지식, 새로운 바인더 지금까지 보고 된 가장 작은 조작된 bispecific 단백질을 나타냅니다. 가능성과 도전 뿐만 아니라이 새로운 전략의 잠재적인 미래의 응용 프로그램을 설명 합니다.
