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Articles by Udo Stenzel in JoVE
JoVE General
Primer Extension Capture: Gezielte Sequence Retrieval von stark degradierte DNA Sources
Max-Planck Institute for Evolutionary Anthropology, Leipzig
Wir präsentieren eine Methode zur gezielten alten DNA-Sequenz Abruf, die wir benutzt, um die komplette mitochondriale Genom von fünf Neandertal Individuen zu rekonstruieren. Der Vergleich dieser Sequenzen mit den heutigen Menschen nahe, dass Neandertaler eine langfristige geringe effektive Populationsgröße hatte.
Other articles by Udo Stenzel on PubMed
Gezielte Hochdurchsatz-Sequenzierung Markierte Nukleinsäure-Proben
Hochdurchsatz-454-DNA-Sequenzierung-Technologie ermöglicht wesentlich schnellere und kostengünstigere Sequenzierung als traditionelle Sanger-Sequenzierung. Jedoch erlegt die Technologie inhärente Beschränkungen für die Anzahl der Samples, die parallel verarbeitet werden können. Hier stellen wir parallel markierte Sequenzierung (PTS), eine einfache, kostengünstige und flexible Barcoding-Technik, die für die parallele, die Sequenzierung beliebiger Anzahl und Typ von Double-Stranded Nukleinsäure-Proben verwendet werden kann. Wir zeigen, dass PTS besonders stark für die Sequenzierung von zusammenhängenden DNA-Fragmente wie MtDNA Genome ist: theoretisch mehr als 250 Säugetier-MtDNA-Genome in einer einzigen GS FLX führen sequenziert werden können. PTS drastisch erhöht den Durchsatz der Sequenzierung von Proben parallel und somit voll mobilisiert die Ressourcen der 454 Technologie für gezielte Sequenzierung.
Muster Der Schaden in Der Genomischen Sequenzen DNA Aus Einer Neandertal
Hochdurchsatz-Direkte Sequenzierung Techniken haben vor kurzem die Möglichkeit zu Genome aus Pleistozän Organismen geöffnet. Hier analysieren wir DNA-Sequenzen, die aus einem Neandertal, Mammuts und Höhlenbären ermittelt. Wir zeigen, dass Purine überrepräsentiert an Positionen, die in der alten DNA, angrenzend an die Pausen darauf hindeutet, dass das Depurination seine Schädigung beigetragen hat. Wir außerdem zeigen, dass die Ersetzungen aus Fehlcodierung Cytosin Rückstände in den DNA-Sequenzen erheblich überrepräsentiert sind und drastisch-Cluster in die Enden der Moleküle, während andere Substitutionen selten sind. Wir präsentieren ein Modell, in denen die beobachteten Ersatz-Muster verwendet werden, um die Rate der Deamination Cytosin Rückstände in Portionen von Einzel- und Doppelstrang-DNA, die Länge der einzelsträngige enden und die Häufigkeit der Nicknamen zu schätzen. Die Ergebnisse legen nahe, dass zuverlässige Genomsequenzen aus Pleistozän Organismen abgerufen werden können.
Parallel Markierte Sequenzierung Auf Der 454-Plattform
Parallele markierte Sequenzierung (PTS) ist eine molekulare Barcoding-Methode entwickelt, die vor kurzem entwickelte Hochdurchsatz-454 parallel Sequenzierung Technik für die Verwendung mit mehreren Proben anzupassen. Im Gegensatz zu anderen Methoden Barcoding PTS kann auf jede Art von Doppelstrang-DNA (DsDNA) Stichprobe, Schrotflinte DNA-Bibliotheken und Schwimmbäder der PCR-Produkte, angewendet werden und erfordert keine Verstärkung oder Gel-Reinigung-Schritte. Die Methode beruht auf Anfügen Probe-spezifische Barcoding-Adaptern, die Sequenz-Tags enthalten, und eine Einschränkung Website, stumpf-End repariert DNA-Proben von Ligaturen und Strang-Weg. Nach der Zusammenlegung mehrerer Barcoded Proben, Moleküle ohne Sequenz-Tags sind effektiv ausgeschlossen Sequenzierung durch Dephosphorylierung und Beschränkung Verdauung, und verwenden die Tag-Sequenzen, die Quelle jeder DNA-Sequenz zurückverfolgt werden kann. Dieses Protokoll ermöglicht Sequenzierung 300 oder mehr komplette mitochondrische Genome auf einen einzigen 454 GS FLX führen, oder 25 6-kb-Plasmid Sequenzen auf nur ein 16. Platte Gebiet. Die meisten Reaktionen können in einem Mehrkanal-Setup auf Reaktion der 96er Platten, zulassend Verarbeitung bis zu mehreren hundert Proben in ein paar Tagen durchgeführt werden.
PatMaN: Schnelle Ausrichtung Der Kurze Sequenzen Zu Großen Datenbanken
Wir präsentieren ein Werkzeug für die Suche nach vielen kurzen Nukleotidsequenzen in großen Datenbanken, geeignet für eine vordefinierte Anzahl von Lücken und Diskrepanzen. Das Commandline-gesteuerte Programm implementiert eine nicht-deterministischen Automaten passenden Algorithmus auf ein Keyword-Struktur der Suchzeichenfolgen. Beide Abfragen mit und ohne Mehrdeutigkeit Codes können durchsucht werden. Suchdauer ist Abkürzung für perfekte Treffer und Abrufzeiten steigt exponentiell mit der Anzahl der Bearbeitungen erlaubt. Verfügbarkeit: Der C++-Quellcode für PatMaN wird unter der GNU General Public License vertrieben und wurde auf dem GNU/Linux-Betriebssystem getestet. Es ist frei von http://bioinf.eva.mpg.de/patman. Zusatzinformationen: Ergänzende Daten sind online abrufbar unter Bioinformatik.
Eine Komplette Neandertal Mitochondrialen Genom-Sequenz Von Hochdurchsatz-Sequenzierung Bestimmt
Eine vollständige mitochondriale (Mt)-Genom-Sequenz wurde mit 8341 MtDNA-Sequenzen identifiziert unter 4,8 Gb von DNA aus ca. 0,3 g Knochen generiert aus einem 38.000 Jahre Neandertal einzelne rekonstruiert. Analyse der montierten Sequenz legt eindeutig fest, dass die Neandertal MtDNA nicht in die Variation der erhaltenen menschlichen MtDNAs fällt und eine Schätzung des Datums Divergenz zwischen den zwei MtDNA Abstammungen von 660.000 +/-140.000 Jahren ermöglicht. Der 13 Proteine codiert in der MtDNA hat 2-Untereinheit des Cytochrom-C-Oxidase der mitochondrialen Atmungskette die größte Zahl von Aminosäure-Ersetzungen in menschlichen Vorfahren seit der Trennung von Neandertals erlebt. Es gibt Hinweise, dass reinigende Selektion aus dem Neandertal MtDNA reduziert wurde mit anderen Primaten-Linien verglichen, was darauf hindeutet, dass die effektive Populationsgröße des Neandertals klein war.
Gezielte Abruf- Und Analyse Von Fünf Neandertal MtDNA Genomen
Analyse von Neandertal DNA hält großes Potential für die Untersuchung der Bevölkerung-Geschichte dieser Gruppe von Homininae, aber Fortschritte sind aufgrund der Seltenheit der Proben und beschädigten Zustand der DNA. Wir präsentieren eine Methode zur gezielten alte DNA Sequenz Abruf bereit, der Probe Zerstörung und Sequenzierung Forderungen erheblich reduziert und verwenden Sie diese Methode, um die komplette mitochondriale DNA (MtDNA) Genome von fünf Neandertals aus in ihrem geografischen Umfeld zu rekonstruieren. Wir finden, dass genetische Diversität der MtDNA in Neandertals, die vor 38.000 bis 70.000 Jahren lebte etwa ein Drittel davon in zeitgenössischen modernen Menschen war. Zusammen mit der Analyse der MtDNA Protein Evolution zufolge diese Daten die langfristige effektive Populationsgröße des Neandertals kleiner als die des modernen Menschen und erhaltenen Menschenaffen war.
Direkte Multiplex-Sequenzierung (DMPS)--eine Neuartige Methode Zur Gezielten Hochdurchsatz-Sequenzierung Der Alten Und Stark Abgebauten DNA
Obwohl die Entstehung von Hochdurchsatz-Technologien ganz-Genom-Sequenzierung von ausgestorbenen Organismen aktiviert hat, hat wenig Fortschritte in gezielte Sequenzierung von stark abgebauten DNA zu beschleunigen. Hier präsentieren wir eine neuartige und hochempfindliche Methode für gezielte Sequenzierung der antiken und degradierten DNA, welche Paare-PCR direkt mit Beispiel Barcoding und Hochdurchsatz-Sequenzierung Multiplex. Mit diesem Ansatz wir entnommen einer Datengruppe 96 % vollständige mitochondriale Genom 31 Höhlenbär (Ursus Spelaeus) Proben mit nur zwei 454 Life Sciences (Roche) GS FLX ausgeführt wird. Im Gegensatz zu früheren Studien, die nur auf kurze Sequenz Fragmente umfasst der überlappende Teil unserer Daten fast 10 kb replizierten mitochondrialen Genom-Sequenz, zulassend die eindeutige Differenzierung der drei großen Höhle Bär Kladen. Unsere Methode eröffnet die Möglichkeit, gleichzeitig viele Kilobases von überlappenden Sequenzdaten aus große Mengen von schwierigen Proben wie Museumsexemplaren, medizinischen Sammlungen oder forensische Proben zu generieren. Eingebettet in unserem Ansatz, präsentieren wir ein neues Protokoll für den Bau von Barcode Sequenzierung Bibliotheken, die ist kompatibel mit allen aktuellen Hochdurchsatz-Technologien und vollständig im Teller-Setup ausgeführt werden können.
Basis Der Ruf Nach Der Illumina Genome Analyzer Mit Maschine Lernstrategien Verbessert
Die Illumina Genome Analyzer generiert Millionen von kurzen Sequenzierung mal gelesen. Wir präsentieren Ibis (verbesserte Basis Identifikationssystem), eine präzise, schnell und einfach zu bedienende Basis Anrufer, die deutlich reduziert die Fehlerquote und erhöht die Ausgabe des nutzbaren mal gelesen. Ibis ist schneller und robuster in Bezug auf Chemie und Technologie als andere öffentlich verfügbaren Pakete. Ibis ist frei verfügbar unter der GPL von http://bioinf.eva.mpg.de/Ibis/.
Entfernung Von Deaminated Cytosines Und Erkennung Der In-vivo-Methylierung in Alte DNA
DNA-Sequenzen, die aus alten Organismen ermittelt haben hohe Fehlerquoten, vor allem durch Uracil Grundlagen erstellt von Cytosin Deamination. Wir verwenden synthetische Oligonukleotide, sowie DNA extrahiert aus Mammut und Neandertal bleibt, um anzuzeigen, dass die Behandlung mit Uracil-DNA-Glycosylase und Endonuklease VIII alte DNA Uracil Rückstände entfernt und repariert die meisten resultierende abasic Websites, unbeschädigt verlassen Teile der DNA Fragmente intakt. Neandertal DNA-Sequenzen, die mit diesem Protokoll bestimmt haben die Genauigkeit stark zugenommen. Darüber hinaus zeigen unsere Ergebnisse, dass Neandertal DNA in vivo Muster der CpG Methylierung, behält sich potenziell so dass zukünftige Studien der Gen-Inaktivierung und Prägung in alten Organismen.
Computational Herausforderungen Bei Der Analyse Der Alte DNA
Hochdurchsatz-Technologien haben eine neue Allee für ausgestorbene Organismen Studium eröffnet. Hier wir identifizieren und quantifizieren der Vorurteile, die von besonderen Merkmalen des alten DNA-Proben eingeführt. Diese Analysen zeigen die Bedeutung der eng verwandten genomischen Sequenz zum richtig identifizieren und Klassifizieren von bona-fide endogener DNA-Fragmente. Wir zeigen, dass die genauere Schätzungen der Genom-Divergenz aus alten DNA-Sequenz können erreicht werden mit mindestens zwei Fremdgruppe Genome und geeignete Filterung.
Ein Entwurf-Sequenz Des Genoms Neandertal
Neandertals, die evolutionären engsten Verwandten des heutigen Menschen, lebte in weiten Teilen von Europa und Westasien vor dem Verschwinden vor 30.000 Jahren. Wir präsentieren eine Entwurf-Sequenz von der Neandertal von mehr als 4 Milliarden Nukleotiden aus drei Personen Genom. Vergleiche des Genoms Neandertal in den Genomen von fünf heutigen Menschen aus verschiedenen Teilen der Welt identifizieren zahlreicher genomischen Regionen, die durch positive Selektion beim Vorfahren moderner Menschen, einschließlich der beteiligten Gene im Stoffwechsel und in der kognitiven und Skelett beeinflusst worden sein könnten. Wir zeigen, dass Neandertals gemeinsam weitere genetischen Varianten mit den heutigen Menschen in Eurasien als mit den heutigen Menschen in Subsahara-Afrika, darauf hindeutet, dass Genfluss von Neandertals in die Vorfahren der nicht-Afrikaner vor die Divergenz der eurasischen Gruppen voneinander aufgetreten sind.
Straßensperren Auf Paleogenomes--Polymerase Erweiterung Profilerstellung Zeigt Die Häufigkeit Der Läsionen Im Alter DNA Blockieren
Obwohl in die letzten Jahren großen Fortschritte in der DNA-Sequenz-Abruf von fossilen Exemplaren gesehen haben, bleiben einige der Merkmale der alte DNA weitgehend unverstanden. Dies gilt insbesondere für blockierende Läsionen, d.h. chemische Veränderungen, die können nicht umgangen werden durch DNA-Polymerasen und verhindern so Amplifizierung und anschließende Sequenzierung der betroffenen Moleküle. Einige Studien haben geschlossen, dass die überwiegende Mehrheit der alten DNA-Moleküle blockierende Läsionen tragen, was darauf hindeutet, dass die Entfernung, die Reparatur oder die Umgehung der Sperrung Läsionen dramatisch die Zeit Tiefe und die geographische Reichweite von Exemplaren zur alten DNA-Analyse zur Verfügung erhöhen. Frühere Studien verwendet jedoch sehr indirekte Nachweismethoden, die nicht schlüssige Schätzungen über die Häufigkeit von Läsionen im endogenen alte DNA blockieren bieten konnte. Wir entwickelten eine neue Methode, Polymerase-Erweiterung (PEP), Profilerstellung, daß direkt Vorkommen der Polymerase abwürgen auf DNA-Vorlagen. Durch Sequenzierung Tausende von einzelnen Primer Extension-Produkte mit PEP-Methodik, haben wir für die ersten Zeit direkt identifiziert blockierende Läsionen in alte DNA auf ein einzelnes Molekül-Ebene. Obwohl wir klare Beweise für das Blockieren von Läsionen in drei der vier alten Proben gefunden, waren nicht mehr als 40 % der Moleküle betroffen, in der Beispiele, die darauf hinweist, dass solche Änderungen weit weniger häufig in alte DNA sind, als bisher angenommen.
Genetische Geschichte Einer Archaischen Homininen-Gruppe Aus Denisowo-Höhle in Sibirien
Mit DNA extrahiert aus einem Finger Knochen gefunden in Denisowo Höhle im südlichen Sibirien, haben wir das Genom von einer archaischen homininen zu etwa 1.9-fold Abdeckung sequenziert. Diese Person ist aus einer Gruppe, die einen gemeinsamen Ursprung mit Neandertalern teilt. Diese Bevölkerung beteiligte sich nicht an die vermeintliche Genfluss vom Neandertaler in Eurasier; jedoch die Daten deuten darauf hin, dass es 4 bis 6 % seiner genetischen Materials in den Genomen von heutigen Melanesier beigetragen. Wir bezeichnen diese homininen-Population 'Denisovans' und legen nahe, dass es während des späten Pleistozäns in Asien weit verbreitet gewesen sein kann. Gefunden in Denisowo Höhle Zahn trägt ein mitochondriales Genom der Finger Knochen sehr ähnlich. Dieser Zahn teilt keine abgeleiteten morphologischen Merkmale mit Neandertalern oder modernen Menschen, weiter, dass Denisovans eine Evolutionsgeschichte von Neandertalern und modernen Menschen zu haben.
