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Articles by Udo Stenzel in JoVE
JoVE General
Primer Capture Estensione: Recupero sequenza mirata da fonti DNA fortemente degradate
Max-Planck Institute for Evolutionary Anthropology, Leipzig
Vi presentiamo un metodo di recupero mirato antica sequenza di DNA, che abbiamo usato per ricostruire il genoma mitocondriale completo di cinque individui Neandertal. Confronto di queste sequenze con gli esseri umani oggi suggerisce che i Neanderthal avevano un lungo periodo bassa dimensione effettiva della popolazione.
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Sequenziamento High-throughput Mirato Di Campioni Contrassegnati Dell'acido Nucleico
Tecnologia di sequenziamento del DNA high-throughput 454 permette molto più veloce e più conveniente sequenziamento di Sanger tradizionale sequenziamento. Tuttavia, la tecnologia impone limitazioni inerenti al numero di campioni che possono essere elaborate in parallelo. Qui presentiamo parallelo tagged sequenziamento (PTS), una tecnica di codifica a barre semplice, economico e flessibile che può essere utilizzato per parallelo sequenziamento qualsiasi numero e tipo di acido nucleico double-stranded campioni. Dimostriamo che PTS è particolarmente potente per la sequenziazione di frammenti di DNA contigui quali genomi mtDNA: in teoria possono essere sequenziati altretanto come 250 genomi dei mammiferi del mtDNA in un singolo GS FLX eseguire. PTS aumenta drammaticamente la velocità effettiva di sequenziamento dei campioni in parallelo e così completamente mobilita le risorse della tecnologia 454 per mirati sequenziamento.
Modelli Di Danno in Genomic DNA Sequenze Da Un Neandertal
Tecniche di sequenziamento diretto ad alta velocità hanno recentemente aperto la possibilità di genomi di sequenza da organismi del Pleistocene. Qui analizziamo le sequenze di DNA determinate da un Neandertal, un mammut e un orso della caverna. Mostriamo che le purine sono sovrarappresentate in posizioni adiacenti per le rotture nel DNA antico, suggerendo che depurinazione ha contribuito alla sua degradazione. Abbiamo inoltre mostrano che le sostituzioni derivanti da miscoding residui della citosina sono notevolmente sovrarappresentate nelle sequenze del DNA e drasticamente raggruppati nelle estremità delle molecole, mentre le altre sostituzioni sono rare. Vi presentiamo un modello dove i modelli di sostituzione osservati sono utilizzati per stimare il tasso di deaminazione dei residui della citosina in porzioni di single e double-stranded del DNA, la lunghezza delle estremità a singolo filamento e la frequenza dei Nick. I risultati suggeriscono che le sequenze di genoma affidabili possono essere ottenuti da organismi del Pleistocene.
Tagged Sequenziamento Sulla Piattaforma 454 in Parallelo
Sequenziamento tagged parallelo (PTS) è un metodo molecolare barcoding progettato per adattare la tecnologia di 454 sequenziamento parallela high-throughput recentemente sviluppati per l'uso con campioni multipli. A differenza di altri metodi di codifica a barre, PT può essere applicato a qualsiasi tipo di campione di double-stranded DNA (dsDNA), tra cui le librerie di DNA fucile e piscine dei prodotti di PCR e non richiede nessuna amplificazione o gel passi di purificazione. Il metodo si basa sull'associare schede campione specifici codici a barre, che includono sequence tags e un sito di restrizione, a smussato-fine riparato i campioni di DNA di legatura e strand-spostamento. Dopo pool di campioni multipli del codice a barre, molecole senza tag sequenza efficacemente sono esclusi dal sequenziamento di defosforilazione e restrizione digestione, e utilizzando le sequenze di tag, la fonte di ogni sequenza di DNA può essere rintracciata. Questo protocollo permette di sequenziamento genoma mitocondriale 300 o più completo su una singola 454 GS FLX esegue, o venti-cinque sequenze del plasmide 6-kb solo uno 16 piastra regione. La maggior parte delle reazioni può essere eseguita in una configurazione multicanale su piastre 96 pozzetti di reazione, che consente per l'elaborazione fino a diverse centinaia di campioni in pochi giorni.
PatMaN: Allineamento Rapido Di Brevi Sequenze Di Database Di Grandi Dimensioni
Vi presentiamo uno strumento adatto per la ricerca di molte sequenze nucleotidiche breve nel database di grandi dimensioni, che consente un numero predefinito di lacune e incongruenze. Il programma basato su riga di comando implementa un automa non deterministico corrispondente algoritmo su un albero di parole chiave delle stringhe di ricerca. Entrambe le query con e senza codici di ambiguità possono essere cercate. Tempo di ricerca è breve per partite perfette, e tempo di recupero aumenta esponenzialmente con il numero di modifiche consentite. DISPONIBILITÀ: Il codice sorgente C++ PatMaN è distribuito sotto la GNU General Public License ed è stato testato su sistema operativo GNU/Linux. È disponibile da http://bioinf.eva.mpg.de/patman. INFORMAZIONI supplementari: Dati supplementari sono disponibili presso bioinformatica online.
Un Neandertal Completa Sequenza Del Genoma Mitocondriale Determinato Dal Sequenziamento Di Alto-rendimento
Una sequenza del genoma mitocondriale completo (mt) è stata ricostruita da un Neandertal di 38.000 anni individuale con 8341 sequenze di DNA mitocondriale identificate tra 4,8 Gb di DNA generato da circa 0,3 g di osso. Analisi della sequenza montata stabilisce inequivocabilmente che il mtDNA di Neandertal non rientra la variazione dei mtDNAs umani esistenti e permette una stima della data divergenza tra i due lignaggi di mtDNA di 660.000 + 140.000 anni. Delle 13 proteine codificate nel mtDNA, subunità 2 di citocromo c ossidasi della catena di trasporto degli elettroni mitocondriale ha sperimentato il maggior numero di sostituzioni dell'amminoacido in antenati umani poiché la separazione da Neandertals. Ci sono prove che purificante selezione nel Neandertal mtDNA è stato ridotto rispetto a altri lignaggi di primate, suggerendo che la dimensione effettiva della popolazione di Neandertals era piccola.
Recupero Mirato E L'analisi Di Cinque Genomi MtDNA Di Neandertal
Analisi del DNA Neandertal detiene un grande potenziale per indagare la storia della popolazione di questo gruppo di ominidi, ma i progressi sono stati limitati a causa della rarità dei campioni e stato danneggiato del DNA. Noi presentiamo un metodo mirato antico DNA sequenza recupero che riduce notevolmente la distruzione del campione e sequenziamento richieste e utilizzare questo metodo per ricostruire il genoma di DNA (mtDNA) mitocondriale completo di cinque Neandertals da attraverso il loro areale geografico. Troviamo che la diversità genetica del DNA mitocondriale in Neandertals che visse 38.000 a 70.000 anni fa era circa un terzo di quello in contemporanei degli esseri umani moderni. Insieme con l'analisi dell'evoluzione della proteina del DNA mitocondriale, questi dati suggeriscono che la dimensione della popolazione efficace a lungo termine di Neandertals era inferiore a quella degli esseri umani moderni e grandi scimmie esistenti.
Multiplex Sequenziamento Diretto (DMPS) - Un Nuovo Metodo Per Mirati High-throughput Di Sequenziamento Del DNA Antico E Altamente Degradato
Sebbene l'emergere delle tecnologie high-throughput sequencing ha permesso intero-genome sequencing da organismi estinti, piccoli progressi compiuti nell'accelerare la sequenziazione mirata da DNA altamente degradato. Qui di seguito, presentiamo un metodo altamente sensibile e romanzo mirati sequenziamento del DNA antico e degradato, quali coppie multiplex PCR direttamente con sequenza di alto-rendimento e campione barcoding. Utilizzando questo approccio, abbiamo ottenuto un set di dati completa del genoma mitocondriale 96% dal 31 orso (Ursus spelaeus) campioni utilizzando solo due 454 Life Sciences (Roche) GS FLX corre. A differenza di precedenti studi basandosi solo su frammenti di sequenza corta, la sovrapposizione porzione dei nostri dati comprende quasi 10 kb di sequenza del genoma mitocondriale replicata, consentendo l'inequivocabile differenziazione delle tre principali grotta orso cladi. Il nostro metodo si apre la possibilità di generare simultaneamente molti kilobasi di sovrapposizione dei dati di sequenza da grandi insiemi di campioni difficili, quali esemplari del Museo, collezioni medicale o campioni forensi. Incorporato nel nostro approccio, vi presentiamo un nuovo protocollo per la costruzione del codice a barre librerie di sequenziamento, che è compatibile con tutte le tecnologie high-throughput attuale e può essere eseguita interamente in installazione piastra.
Migliorata Base Chiamata Per L'Illumina Genome Analyzer Utilizzando Strategie Di Apprendimento Di Macchina
La Illumina Genome Analyzer genera milioni di letture brevi sequenze. Vi presentiamo Ibis (migliorato il sistema di identificazione base), un chiamante base preciso, veloce e facile da usare che notevolmente riduce il tasso di errore e aumenta l'output di letture utilizzabile. Ibis è più veloce e più robusto rispetto alla chimica e la tecnologia di altri pacchetti disponibili pubblicamente. Ibis è liberamente disponibile sotto la licenza GPL da http://bioinf.eva.mpg.de/Ibis/.
Rimozione Di Cytosines Deaminati E Rilevamento Di Metilazione in Vivo Nel DNA Antico
Sequenze di DNA determinate da antichi organismi hanno tassi di errore elevato, principalmente a causa di uracile basi creati da deaminazione della citosina. Usiamo oligonucleotides sintetici, come pure il DNA Estratto da mammut e resti di Neandertal, per mostrare che il trattamento con uracile-DNA-glycosylase ed endonucleasi VIII rimuove i residui di uracile dal DNA antico e ripara la maggior parte dei siti abasic risultante, lasciando integro parti del DNA frammenti intatti. Sequenze di DNA Neandertal determinate con questo protocollo hanno notevolmente aumentato la precisione. Inoltre, i nostri risultati dimostrano che DNA Neandertal conserva modelli in vivo di CpG metilazione, potenzialmente permettendo che gli studi futuri di inattivazione del gene e l'imprinting di antichi organismi.
Sfide Computazionale Nell'analisi Del DNA Antico
Tecnologie high-throughput sequencing hanno aperto una nuova strada per lo studio degli organismi estinti. Qui noi identificare e quantificare le distorsioni introdotte da particolari caratteristiche di antichi campioni di DNA. Queste analisi dimostrano l'importanza della sequenza genomica strettamente correlata per identificare e classificare i frammenti di DNA endogeni bona fide correttamente. Dimostriamo che il genoma divergenza stime più accurate dalla sequenza del DNA antico possono essere raggiunto utilizzando almeno due outgroup genomi e filtraggio appropriato.
Una Sequenza Di Bozza Del Genoma Di Neandertal
Neandertals, i parenti evolutivi più vicini degli esseri umani dell'attuale, vissuto nelle grandi parti di Europa e dell'Asia occidentale prima di sparire 30.000 anni fa. Vi presentiamo una sequenza di bozza di Neandertal genoma è composto da più di 4 miliardi di nucleotidi da tre individui. Confronti del genoma di Neandertal per i genomi dei cinque esseri umani attuali provenienti da diverse parti del mondo identificano un numero di regioni genomiche che potrebbe essere stata influenzata dalla selezione positiva in esseri umani moderni ancestrali, inclusi geni coinvolti nel metabolismo e nello sviluppo cognitivo e scheletrico. Mostriamo che Neandertals condivisi più varianti genetiche con gli esseri umani attuali in Eurasia rispetto con gli esseri umani attuali nell'Africa subsahariana, suggerendo che flusso genico da Neandertals negli antenati degli africani non si è verificato prima la divergenza dei gruppi Eurasian da altro.
Storia Genetica Di Un Gruppo Di Ominidi Arcaici Dalla Grotta Di Denisova in Siberia
Usando il DNA Estratto da un osso di dito trovato nella grotta di Denisova nella Siberia meridionale, noi abbiamo sequenziato il genoma di un arcaico ominidi a copertura di circa 1.9-fold. Questo individuo è un gruppo che condivide un'origine comune con i Neanderthal. Questa popolazione non è stata coinvolta nel flusso del gene putativo dall'uomo di Neanderthal in eurasiatici; Tuttavia, i dati suggeriscono che ha contribuito a 4-6% del suo materiale genetico per i genomi dei Melanesiani odierna. Noi designare questa popolazione ominidi 'Denisovans' e suggeriscono che potrebbe essere stato diffuso in Asia durante il tardo Pleistocene. Un dente trovato nella grotta di Denisova trasporta un genoma mitocondriale molto simile a quella dell'osso di dito. Questo dente non condivide derivate caratteristiche morfologiche con Neanderthal o gli esseri umani moderni, ulteriormente indicando che Denisovans hanno una storia evolutiva distinta dall'uomo di Neanderthal e degli esseri umani moderni.
Blocchi Stradali Su Paleogenomes - Polimerasi Estensione Profilatura Rivela La Frequenza Delle Lesioni Nel DNA Antico Di Blocco
Anche se gli ultimi anni hanno visto grandi progressi nel recupero di sequenza del DNA da campioni fossili, alcune delle caratteristiche del DNA antico rimangono scarsamente comprensibile. Questo è particolarmente vero per bloccare lesioni, alterazioni chimiche cioè che non possono essere aggirate da una polimerasi del DNA e quindi impediscono amplificazione e successivo sequenziamento di molecole colpite. Alcuni studi hanno concluso che la stragrande maggioranza delle molecole di DNA antichi porta bloccare lesioni, suggerendo che la rimozione, riparazione o bypass di bloccare le lesioni potrebbe aumentare drammaticamente la profondità del tempo e la gamma geografica degli esemplari disponibili per l'analisi del DNA antica. Tuttavia, precedenti studi utilizzati metodi di rilevamento molto indiretto che non hanno fornito stime conclusive sulla frequenza delle lesioni in ancient DNA endogeno di blocco. Abbiamo sviluppato un nuovo metodo, estensione della polimerasi profilatura (PEP), che rivela direttamente occorrenze di stallo sui modelli del DNA polimerasi. Sequenziando migliaia di prodotti di estensione dell'iniettore singolo utilizzando la metodologia PEP, abbiamo per la prime volta identificato direttamente blocco lesioni in ancient DNA a livello di singola molecola. Anche se abbiamo trovato prove evidenti per lesioni in tre dei quattro antichi campioni di blocco, non più del 40% delle molecole sono stato colpito in uno qualsiasi dei campioni, indicando che tali modifiche siano molto meno frequenti nel DNA antico quanto si pensasse.
