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Articles by Uttiya Basu in JoVE
JoVE Immunology and Infection
Recombinante de production et infection rétrovirale des cellules B
1Department of Microbiology and Immunology, Columbia University College of Physicians and Surgeons, 2Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University
Un système efficace de structure et de l'analyse fonctionnelle d'un gène dans une
Other articles by Uttiya Basu on PubMed
La Phosphorylation De Mammifères Facteur Initiation De La Traduction Eucaryote 6 Et Son Tif6p Saccharomyces Cerevisiae Homologue: Preuve Que La Phosphorylation De Tif6p Régule Sa Distribution Nucléocytoplasmique Et Est Nécessaire Pour La Croissance Cellulaire De Levure
La synthèse de sous-unités 60S ribosomique chez Saccharomyces cerevisiae exige Tif6p, l'homologue de levure de mammifères facteur d'initiation de traduction eucaryote 6 (eIF6). Dans le présent travail, nous avons isolé une protéine kinase à partir de lysats de réticulocytes de lapin sur la base de sa capacité à phosphoryler recombinant eIF6 humaine. L'analyse par spectrométrie de masse ainsi que les propriétés antigéniques de la kinase purifiée a identifié comme la caséine kinase I. Le site de phosphorylation in vitro dans, ce qui est hautement conservée de la levure aux mammifères, a été identifié comme les résidus sérine aux positions 174 (site majeur) et 175 (site mineur). Le Tif6p homologue de levure de protéines a également été phosphorylée in vivo dans les cellules de levure. La mutation de la sérine à Tif6p-174 en alanine phosphorylation réduite de façon drastique et causé la perte de la croissance et la viabilité cellulaire. Lorsque les deux Ser-174 et Ser-175 ont été mutés en alanine, la phosphorylation de Tif6p était complètement abolie. En outre, alors que de type sauvage a été distribué à la fois Tif6p dans les noyaux et le cytoplasme des cellules de levure, le Tif6p mutant (avec Ser174Ala et Ser175Ala) est devenu une protéine constitutive nucléaire. Ces résultats suggèrent que la phosphorylation Ser-174 et Ser-175 jouent un rôle essentiel dans l'exportation nucléaire de Tif6p.
L'enzyme AID Diversification De L'anticorps Est Réglementée Par La Protéine Kinase A Phosphorylation
Les anticorps, qui sont produites par les cellules de la lignée B, se composent de lourde des immunoglobulines (IgH) et légers (IGL) des chaînes qui ont amino-terminales des régions variables et carboxy-terminales des régions constantes. En réponse à des antigènes, les cellules B subissent deux types d'altérations génomiques pour accroître la diversité des anticorps. Affinité pour l'antigène peut être augmentée par l'introduction de mutations ponctuelles dans IgH et IGL régions variables par hypermutation somatique. En outre, les fonctions effectrices des anticorps peut être modifiée en changeant les exons exprimées IgH région constants par recombinaison IgH de commutation de classe des entreprises (RSE). Hypermutation somatique et de la RSE à la fois exiger que le B-spécifique des cellules induite par activation des protéines cytidine désaminase (AID), qui initie ces réactions par le biais de sa simple brin (ss) spécifique de l'ADN activité cytidine désaminase. Dans les dosages biochimiques, de protéines de réplication A (RPA), une protéine de liaison ADN simple brin, associés avec l'AID phosphorylée à partir de cellules B activées et renforce l'activité d'IAD sur transcrit double brin (ds) ADN contenant hypermutation somatique ou des séquences cibles en matière de RSE. Cette association AIDES-APR, qui nécessite la phosphorylation, peut fournir un mécanisme pour permettre à l'AID d'accéder à des cibles ADN double brin dans les cellules B activées. Ici, nous montrons que l'AID à partir de cellules B est phosphorylée sur une protéine kinase consensus Un site (PKA) et que la PKA est la kinase AID physiologique. Ainsi, l'aide à partir des cellules non lymphoïdes peuvent être fonctionnellement phosphorylée par la PKA recombinant pour permettre l'interaction avec l'APR et de promouvoir la désamination de substrats dsDNA transcrits. En outre, la mutation du site de phosphorylation PKA majeure de l'AID conserve l'activité désamination ADNsb, mais réduit nettement l'APR-dépendante l'activité désamination ADNdb et compromet gravement la capacité de l'AID pour effectuer la RSE in vivo. Nous concluons que la PKA a un rôle essentiel dans la régulation post-traductionnelle de l'activité d'IAD dans les cellules B.
AID Dans L'hypermutation Somatique Et Recombinaison De Commutation De Classe
Hypermutation somatique et la classe-switch-recombinaison sont initiés par la désamination de la désoxycytosine dans l'ADN par l'activation induite par-désaminase, l'AID. Récemment, on a eu beaucoup de recherches sur la façon dont l'AID cible ADN double-brin dans les sous-régions de gènes d'Ig, l'implication des co-facteurs et les modifications post-traductionnelles dans ce processus, la cooptation des mécanismes de «réparation» d'ADN et de l'évolution AID.
Règlement De La Désaminase Activation Induced Via La Phosphorylation
La diversification des gènes d'immunoglobulines par hypermutation somatique (SHM), la recombinaison de commutation de classe des entreprises (RSE), et la conversion génique dépend de la cytidine désaminase induite par activation (AID). AID est une désaminase l'ADN simple brin cytidine spécifique qui est exprimé principalement dans les lymphocytes B matures activées. AIDE semble catalyser la désamination cytidine ADN de lourdes des immunoglobulines (IgH) et la chaîne légère (IGL) variables (région V) exons et IgH séquences de commutation région (s) à engager, respectivement, IgH et IGL somatiques hypermutation (SHM) et de commutation de classe IgH recombinaison des entreprises (RSE). Ici, nous allons discuter des implications des études récentes qui démontrent le rôle de la phosphorylation de l'AID en augmentant l'activité d'IAD par rapport à ces deux processus.
Evolution De L'immunoglobuline De Classe De La Chaîne Mécanisme Lourd Recombinaison De Commutation
Pour monter une réponse immunitaire optimale, les lymphocytes B matures peuvent changer la classe d'anticorps exprimé d'IgM à IgG, IgA ou IgE à travers un processus de recombinaison / suppression appelé chaîne lourde d'immunoglobuline (IgH) recombinaison de commutation de classe des entreprises (RSE). La RSE exige la cytidine désaminase induite par activation (AID), qui a été montré à employer l'ADN simple brin comme un substrat in vitro. IgH RSE se produit à l'intérieur et nécessite de grandes séquences répétitives, des régions appelées S, qui sont des parties d'unités de transcription germinales (appelé "C (H) des gènes") qui sont composées de promoteurs, les régions S et individuels exons IgH région constante. La RSE exige et est dirigé par la transcription de la lignée germinale de participer C (H) des gènes préalablement à la RSE. Désamination AID de cytidines dans les régions S semble conduire à S de la région cassures bicaténaires (CDB) nécessaires pour initier la RSE. Assemblage de deux régions S cassés pour compléter la RSE exploite les activités des mécanismes de réparation d'ADN générales ORD. Dans ce chapitre, nous discutons de nos connaissances actuelles sur la fonction des régions S, la transcription de la lignée germinale, l'AID, et réparation de l'ADN en matière de RSE. Nous présentons un modèle pour la RSE dans lequel la transcription à travers les régions S fournit des substrats d'ADN à laquelle l'AID peut générer ORD induisant des lésions. Nous discutons aussi comment la phosphorylation de l'AID peut servir de médiateur des interactions avec des cofacteurs qui facilitent l'accès aux régions S transcrites lors de la RSE et transcrites régions variables au cours du processus connexe de l'hypermutation somatique (SHM). Enfin, dans le cadre de ce modèle RSE, nous avons encore discuter des résultats actuels suggèrent que les synapses et la jonction de la région S CDB lors de la RSE ont évolué pour exploiter les mécanismes généraux qui fonctionnent à se joindre largement séparés CSD chromosomiques.
Saccharomyces Cerevisiae 60 S Tif6p Ribosome Facteur Biogenesis Est Réglementée Par Hrr25p Médiée Par Phosphorylation
La biosynthèse de sous-unités ribosomales 60 S chez Saccharomyces cerevisiae exige Tif6p, l'homologue de levure de eIF6 mammifères. Cette protéine est nécessaire pour la formation de sous-unités ribosomales 60 S, car il est essentiel pour le traitement de 35 S pré-ARNr de la maturité 25 S et S ARNr 5,8. Dans le présent travail, en utilisant des analyses génétiques moléculaires et biochimiques, nous montrons que Hrr25p, une isoforme de la levure de la caséine kinase I, phosphoryle Tif6p la fois in vitro et in vivo. Trypsique cartographie phosphopeptide in vitro phosphorylée par Tif6p Hrr25p et (32) P-marqué Tif6p isolé à partir des cellules de levure suivie par une analyse par spectrométrie de masse révélé que la phosphorylation produite sur un seul peptide trypsique à Ser-174. Fractionnement sur gradient de saccharose et d'expériences co-immunoprécipitation montrent qu'une fraction faible mais significative de Hrr25p est lié aux particules preribosomal 66 S qui contiennent également des Tif6p lié. L'épuisement des Hrr25p à partir d'un mutant de levure conditionnelle qui ne parvient pas à phosphoryler Tif6p n'a pas pu traiter pré-ARNr efficacement, ce qui entraîne une réduction significative dans la formation de 25 S rRNA. Ces résultats, ainsi que nos observations précédentes que phosphorylable Ser-174 est requis pour la croissance des cellules de levure et de la viabilité, suggèrent que Hrr25p médiée par la phosphorylation de Tif6p joue un rôle essentiel dans la biogenèse des sous-unités ribosomales 60 S dans les cellules de levure.
Evolution De La Phosphorylation Dépendante De Règlement De La Désaminase Induite Par Activation Cytidine
Interaction de l'activation induite par la cytidine désaminase (AID) avec des protéines de réplication A (RPA) a été proposé de promouvoir l'accès à l'AID transcrit double brin (ds) ADN au cours de chaîne légère d'immunoglobuline lourde et recombinaison de commutation de la chaîne de classe (RSE). AIDE souris (MAID) l'interaction avec l'APR et la transcription dépendante de la désamination ADNdb in vitro nécessite la protéine kinase A phosphorylation (PKA) à sérine 38 (S38), et normal MAID RSE activité dépend de S38. Toutefois, l'AID le poisson-zèbre (ZAID) catalyse solide RSE dans les cellules de souris malgré l'absence d'un site S38-équivalent PKA. Ici, nous montrons que l'aspartate 44 (D44) en fournit ZAID similaires in vitro et in vivo la fonctionnalité comme la servante de la phosphorylation S38. En outre, l'introduction d'un site PKA dans un mutant ZAID D44 fait PKA dépendante pour les activités in vitro et restauré l'activité normale de la RSE. Sur la base de ces constatations, nous avons généré des mutants de la même jeune fille qui fonctionnent indépendamment de la phosphorylation S38. Comparaison des poissons osseux par rapport sida d'amphibiens et de mammifères suggère divergence évolutive à partir constitutive de la PKA-réglementé APR / interaction AID.
Post-traductionnelle De Règlement Cytidine Deaminase Activation Induite Par
Les gènes des immunoglobulines assemblées dans les cellules B de souris et les humains sont altérées par des processus distincts connus sous le nom de recombinaison de commutation de classe des entreprises (RSE) et l'hypermutation somatique, ce qui conduit à la diversification du répertoire d'anticorps. Ces deux procédés de modification de l'ADN sont initiées par la cellule B-spécifique désaminase protéine du facteur activation-induced cytidine (AID). AID est modifications post-traductionnelles par phosphorylation sur plusieurs sites, bien que l'importance fonctionnelle au cours de la RSE a été responsable que de la phosphorylation sur la serine-38 (S38). Bien que plusieurs laboratoires ont démontré que la fonction AIDE est réglementée via la phosphorylation au S38, le rôle biologique précis de la phosphorylation de S38 a été un sujet de débat. Ici, nous discutons de notre interprétation de la signification de la réglementation de l'aide via la phosphorylation et aussi discuter de la façon dont cette forme de règlement sur l'aide peuvent avoir évolué chez les organismes supérieurs.
Intégrité De L'AID-38 Serine Phosphorylation Du Site Est Crucial Pour La Commutation Isotypique Et Hypermutation Somatique Chez La Souris
Cytidine désaminase induite par activation (AID) est un simple brin (ss) cytidine désaminase spécifique de l'ADN qui initie la chaîne lourde Ig (IgH) recombinaison de commutation de classe des entreprises (RSE) et Ig somatiques hypermutation (SHM) par cytidines Désamination au sein, respectivement, IgH commutateur (S) et les régions variables des Ig région (V) exons. AID qui est phosphorylée sur 38 résidu sérine interagit avec la protéine de réplication A accès (RPA), une protéine de liaison ADN simple brin, de promouvoir la désamination de la transcription d'ADN double brin in vitro, qui, avec d'autres preuves, suggère que l'aide peut même gagner à transcrire régions S et V exons in vivo. Cependant, le rôle physiologique de la phosphorylation de l'AID à 38 résidus sérine (S38), et même l'obligation pour le résidu S38, à l'égard de la RSE ou SHM a été débattue. Pour résoudre ce problème, nous avons utilisé le ciblage de gènes pour générer un locus de souris endogène AID qui produit l'AID dans lequel S38 est substitué par l'alanine (AID (S38A)), une forme mutante de l'AID qui conserve même activité catalytique sur ssDNA que l'AID WT (AID (WT)). Les cellules B homozygotes pour l'aide (S38A) mutation montrent sensiblement altérée RSE et SHM, en corrélation avec l'incapacité de l'AID (S38A) pour interagir avec l'APR endogène. En outre, les souris haploinsuffisant de l'AID (S38A) ont encore plus sévèrement altérée lorsque la RSE par rapport aux souris haploinsuffisant de l'AID (WT), avec des niveaux en matière de RSE ramenés à des niveaux de fond près de. Ces résultats démontrent sans équivoque que l'intégrité du site de phosphorylation AID S38 est nécessaire pour la RSE et SHM normale chez les souris et appuient fortement un rôle pour la phosphorylation AID à S38 et l'interaction dans la régulation de l'APR RSE et SHM.
Régulation De L'activation Induite Par L'activité Cytidine Désaminase Désamination D'ADN Dans Les Cellules B Par Phosphorylation Ser38
L'homme et de la souris les gènes d'Ig sont diversifiés dans les cellules B matures par des processus distincts connus comme la chaîne lourde Ig RSE (commutation isotypique) et Ig variable exon région SHM (hypermutation somatique). Ces procédés d'ADN-modification sont initiées par l'AID (désaminase induite par activation de cytidine), une cytidine désaminase ADN essentiellement exprimé dans les cellules B activées. AID est post-transcriptionnel régulé par des mécanismes multiples, y compris la réglementation microARN, nucléocytoplasmique navette, l'ubiquitination et la phosphorylation. Parmi ces processus de réglementation, la phosphorylation AID au Ser (38) a été un objet d'étude particulièrement intense et le débat. Dans le présent document, nous discutons des dernières biochimiques et de la souris les études génétiques qui commencent à élucider la signification fonctionnelle de l'AID Ser (38) la phosphorylation dans le contexte de l'évolution de ce mode de règlement sur l'aide et les rôles potentiels qu'elles peuvent jouer dans B activés les cellules au cours d'une réponse immunitaire normale.
Le Exosome ARN Cible Le Cytidine Deaminase AID Pour Les Deux Brins De L'ADN Double Brin Transcribed Substrats
Activation-induced cytidine désaminase (AID) initie des immunoglobulines (Ig) de recombinaison de la chaîne lourde (IgH) de commutation de classe des entreprises (RSE) et Ig région variable hypermutation somatique (SHM) dans les lymphocytes B par désaminante cytidines sur modèle et des brins d'ADN de substrats nontemplate transcrits. Cependant, le mécanisme d'accès à l 'AID brin d'ADN matrice, en particulier lorsqu'elles sont hybridées à une transcription ARN naissante, a été une énigme. Nous avons maintenant impliquer le exosomes ARN, un complexe RNA-processing/degradation cellulaire, en ciblant l'aide à deux brins d'ADN. Dans les cellules de lignée B activés pour la RSE, les associés d'ARN exosomes avec l'AID, s'accumule sur les régions de commutation IgH dans un mode dépendant de l'aide, et est nécessaire pour la RSE optimale. En outre, à la fois le complexe ARN cellulaire exosomes et un complexe d'ARN recombinant coeur exosomes de répandre AIDE-et robuste de la transcription dépendante de l'ADN désamination des deux brins de transcrite SHM substrats in vitro. Nos résultats révèlent un rôle de surveillance pour les machines ARN non codant pour générer la diversité des anticorps.
Le Facteur De Transcription BATF Contrôle Des Régulateurs Globaux De La Classe-interrupteur Recombinaison Dans Les Cellules B Et Cellules T
Le facteur de transcription BATF contrôle de la différenciation de l'interleukine 17 (IL-17) de production de lymphocytes T auxiliaires (T (H) 17 cellules) en régulant l'expression de l'RORγt facteur de transcription elle-même et les gènes cibles RORγt comme IL17. Nous rapportons ici le mécanisme par lequel BATF contrôle in vivo de classe interrupteur recombinaison des entreprises (RSE). Dans les cellules T, BATF directement commandé expression des facteurs de transcription Bcl-6 et c-Maf, qui tous deux sont nécessaires pour le développement de cellules T auxiliaires folliculaires (T (FH) cellules). Restaurer l'activité des cellules T (FH) d'BATF (- / -) dans les cellules T in vivo de co-expression requise Bcl-6 et c-Maf. Dans les cellules B, BATF directement commandé à la fois l'expression de la cytidine désaminase induite par activation (AID) et des transcriptions de lignée germinale de l'intervalle de chaîne lourde et la région constante de chaîne lourde région (I (H)-C (H)). Ainsi, les fonctions BATF à de multiples niveaux hiérarchiques dans deux types de cellules à l'échelle mondiale réguler les réponses d'anticorps in vivo commutés.
