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Articles by Vaibhav B. Shah in JoVE
JoVE Immunology and Infection
In vitro Uncoating von HIV-1-Kerne
Department of Pathology, Microbiology and Immunology, Vanderbilt University School of Medicine
Uncoating ist ein wesentlicher Schritt in der frühen Phase der HIV-1 Lebenszyklus und wird als der Demontage der Kapsid-Shell und die Freisetzung des viralen Ribonukleoproteinkomplex (vRNP) definiert. Hier zeigen wir Techniken zur Isolierung von intakten Kernen aus HIV-1 Virionen und zur Quantifizierung ihrer uncoating
Other articles by Vaibhav B. Shah on PubMed
Beta-Glucan Aktiviert Mikroglia, Ohne Damit Cytokine Produktion Dectin-1-abhängigen Weise
Mikroglia sind die mononukleären phagozytische Zellen, die kritisch für angeborene und adaptive Reaktionen innerhalb der CNS. Wie andere immune Zellen Mikroglia erkennen und durch verschiedene Pathogen-assoziierte Molekulare Muster aktiviert. Beta-Glucane sind Pathogen-assoziierte Molekulare Muster in pilzartige Zellwände, die bekanntermaßen schützende Antworten in einer Reihe von Immunzellen auslösen. In dem Bemühen, Microglial Responses to Beta-Glucane und die zugrunde liegenden Antwort Wege besser zu verstehen suchte wir bestimmen, ob Dectin-1, ein kürzlich identifiziert in Leukozyten, großen Beta-Glucan-Rezeptor eine ähnliche Rolle in Beta-Glucan-induzierte Aktivierung in Mikroglia spielt. In dieser Studie berichten wir, dass Dectin-1 sich in der Tat auf der Oberfläche des murinen primären Mikroglia drückt und Engagement des Rezeptors mit Partikel Beta-Glucan führte zu einem Anstieg der Tyrosin-Phosphorylierung von Milz-Tyrosinkinase, ein Markenzeichen-Feature von den Dectin-1-Signalweg. Darüber hinaus wurden Phagozytose von Beta-Glucan-Teilchen und nachfolgende intrazellulären Produktion von reaktive Sauerstoffspezies auch vermittelt durch Dectin-1. Jedoch im Gegensatz zu in Makrophagen und dendritischen Zellen, Beta-Glucan-vermittelter Microglial Aktivierung nicht bedeutende Produktion von Cytokinen oder Chemokine führt; Das Zusammenspiel von Microglial Dectin-1 mit Glucan löst also eine eindeutige Antwort. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die Dectin-1-Pathway Antipilz-Festigkeit im ZNS eine wichtige Rolle spielen kann.
Vav1 Und PI3K Sind Erforderlich Für Die Phagozytose Von Beta-Glucan Und Nachfolgende Superoxid-Generation Von Mikroglia
Mikroglia sind die Residenten angeborenen immune Zellen, die kritisch für angeborene und adaptive Immunantworten innerhalb des CNS. Sie erkennen und durch Pathogen-assoziierte Molekulare Muster (PAMPs) auf der Oberfläche von Krankheitserregern vorhanden aktiviert. Beta-glucane, die großen PAMP in pilzartige Zellwände, werden von Dectin-1, erkannt, die zahlreiche intrazelluläre Veranstaltungen durch Beta-Glucane in verschiedenen Immunzellen aufgerufen vermittelt. Zuvor, zeigten wir, dass Dectin-1 Phagozytose von Beta-Glucan und nachfolgende Superoxid-Produktion in der Mikroglia vermittelt. Hier berichten wir, dass die Guaninnukleotid-Austauschfaktor Vav1 sowie die Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K) sind nachgeschaltete Vermittler von was jetzt als die Dectin-1-Signalweg erkannt wird. Vav1 und PI3K auf Anregung der Mikroglia mit Beta-Glucane aktiviert sind, und die zwei Proteine sind für die Phagozytose der Glucan-Teilchen und für nachfolgende Superoxid-Produktion benötigt. Wir zeigen auch, dass Vav1 stromaufwärts Funktionen von PI3K und ist erforderlich für die Aktivierung der PI3K. Gemeinsam bieten unsere Ergebnisse einen wichtigen Einblick in die mechanistische Aspekte der Microglial Aktivierung als Reaktion auf Beta-Glucane.
Beta-Glucan Dämpft TLR2 Und TLR4-vermittelte Cytokine Produktion Von Mikroglia
Mikroglia, die ansässigen Immunzellen des Gehirns, in Reaktion auf jede Art von CNS Verletzung aktiviert sind, und ihre Aktivierung ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Homöostase innerhalb des CNS. Jedoch erlittenen während Entzündungen, Microglial Aktivierung führt zu Schäden an umgebenden Nervenzellen. Beta-Glucane sind weithin anerkannter Immunmodulatoren, aber die molekularen Mechanismen ihre immunmodulatorische Maßnahmen nicht vollständig erforscht. Zuvor berichteten wir, dass Beta-Glucane Mikroglia durch Dectin-1 aktivieren, ohne damit beträchtliche Zytokine und Chemokine. Hier zeigen wir, dass Partikel Beta-Glucane Cytokine Produktion in Reaktion auf TLR Stimulation dämpfen; Diese hemmenden Wirkung von Beta-Glucan ist von Dectin-1 vermittelt und erfordert keine Partikel Internalisierung. Auf molekularer Ebene unterdrückt Beta-Glucan TLR-vermittelte NF-KappaB Aktivierung, die für die Diminished-Kapazität der Mikroglia verantwortlich sein kann, um Zytokine in Reaktion auf TLR Stimulation zu produzieren. Insgesamt deuten diese Ergebnisse, Beta-Glucane verwendet werden können, zu verhindern oder übermäßige Microglial Aktivierung bei chronischen entzündlichen Erkrankungen zu behandeln.
HIV Nukleare Eintrag: Deaktivieren Des Nebels
HIV-1 und andere Lentiviruses haben die ungewöhnliche Fähigkeit des nondividing Zellen zu infizieren, aber der Mechanismus, mit dem sie eine intakte Kernmembrane kreuzen, ist geheimnisvoll. Jüngsten Arbeiten, einschließlich einer neuen Studie (Lee, K.; Ambrose, Z.; Martin, T.D.; Oztop, I.; Mulky, A.; Julias, j.g.; Vandergraaff, N.; Baumann, j.g.; Wang, R.; Yuen, W. Et Al. Flexible Nutzung nuklearer Import Pathways von HIV-1. Cell Host Microbe2010, 7, 221-233) bestätigt, dass das virale Kapsid eine Schlüsselrolle in HIV-1 nukleare Eintrag in beiden spielt Zellen teilen und nondividing. Identifizierung von Mutationen im viralen Kapsid, die das Virus-Abhängigkeit Host Zelle Nucleoporins ändern stellt einen bedeutenden Fortschritt in dieser Verständnismängel Phase des Lebenszyklus des Virus.
Klein-Molekül Hemmung Des Humanen Immundefizienz-Virus Typ 1-Infektion Durch Virus-Kapsid-Destabilisierung
Human-Immunodeficiency-Virustyp 1 (HIV-1) Infektion ist abhängig von der richtigen Demontage des viralen Kapsid oder "uncoating," in die Zielzellen. Das Kapsid HIV-1 besteht aus einem konischen werden Komplex von das virale Kapsidprotein (CA) in einem hexagonalen Gitter angeordnet. Mutationen im CA, die das virale Kapsid-Ergebnis in destabilisieren beeinträchtigt Infektion wegen Mängel in reverse Transkription in Zielzellen. Wir beschreiben hier den Wirkmechanismus von ein kleines Molekül HIV-1-Hemmer, PF-3450074 (PF74), welche Ziele CA. PF74 verhält sich in einem frühen Stadium der HIV-1 Infektion und hemmt reverse Transkription in Zielzellen. Wir zeigen, dass PF74 spezifisch an HIV-1-Teilchen bindet und Ersetzungen in CA, die Widerstand gegen die Substanz verleihen Bindung verhindern. Eine einzelne Punkt-Mutation in CA, die den HIV-1-Kern stabilisiert verlieh auch starken Widerstand gegen das Virus ohne Hemmung zusammengesetzte Bindung. Behandlung von HIV-1-Teilchen oder gereinigte Kerne mit PF74 destabilisiert das virale Kapsid in-vitro. Darüber hinaus induziert die Verbindung die schnelle Auflösung der HIV-1-Kapsid in Zielzellen. PF74 antivirale Aktivität wurde befördert durch Bindung von der Host Protein Cyclophilin A auf das HIV-1-Kapsid und PF74 und Cyclosporin ausgestellt gegenseitigen Antagonismus. Unsere Daten zeigen, dass PF74 vorzeitige HIV-1 in Zielzellen, ungestrichen imitiert dabei die Aktivität des Faktors Beschränkung Retroviren TRIM5α auslöst. Diese Studie unterstreicht ungestrichen als Schritt im Lebenszyklus HIV-1, die anfällig für kleine Molekül Intervention ist.
Rhesus TRIM5α Stört Das HIV-1-Kapsid an Den Inter-Hexamer-Schnittstellen
TRIM Proteine spielen wichtige Rollen in der angeborenen Immunabwehr gegen Retroviren Infektion, einschließlich humanen Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1). Rhesusaffe TRIM5α (TRIM5α(rh)) zielt auf das HIV-1-Kapsid und Infektion frühzeitig Nettozahlern, vor reverse Transkription blockiert. Studien haben gezeigt, dass Bindung von TRIM5α an die versammelten Kapsid unbedingt Beschränkung und erfordert die aufgerollte Spule und B30.2/SPRY-Domänen, sondern die molekulare Mechanismen der Einschränkung wird nicht vollständig verstanden. In dieser Studie untersuchten wir von CryoEM kombiniert mit Mutagenese und chemische Vernetzung, die direkten Interaktionen zwischen HIV-1-Kapsid-Proteine (CA)-Assemblys und gereinigten TRIM5α(rh) mit aufgerollte Spule und SPRY-Domains (CC-SPRY(rh)). Konzentration-abhängige Bindung des CC-SPRY(rh) CA-Assemblys wurde beobachtet, während unter den gleichen Bedingungen das menschliche Protein nicht gebunden. Wichtig ist, gestört CC-SPRY(rh), aber nicht ihre menschliche Entsprechung, CA Rohre nicht zufällige Weise freigeben Fragmente von Protofilaments bestehend aus CA Hexamers ohne Dissoziation in Monomere. Darüber hinaus wurde diese strukturelle Zerstörung von inter-Hexamer Vernetzung mit P207C/T216C Mutant CA mit Disulfidbrücken an der CTD-CTD Trimer Schnittstelle Kapsid Assemblys, aber nicht von Intra-Hexamer Vernetzung über A14C/E45C an der Schnittstelle von NTD-NTD verhindert. Die gleiche Störung-Wirkung von TRIM5α(rh) auf die Inter-Hexamer-Schnittstellen ist auch mit gereinigtem intakt HIV-1-Kernen aufgetreten. Diese Ergebnisse liefern Erkenntnisse über wie TRIM5α Virion Kern stört und zeigen, dass struktureller Schäden der viralen Kapsid von TRIM5α wahrscheinlich die wichtigen Komponenten des Mechanismus der TRIM5α-vermittelte HIV-1-Einschränkung ist.
