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Articles by Valerica Raicu in JoVE
JoVE General
En la cuantificación in vivo de interacciones de proteínas G del receptor acoplado con espectralmente resuelve de dos fotones de Microscopía
1Department of Physics, University of Wisconsin - Milwaukee, 2Department of Biological Sciences, University of Wisconsin - Milwaukee
Mediante el empleo de un espectro resuelto de dos fotones sistema de imágenes de microscopía, a nivel de píxel de mapas de transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) se obtienen eficiencias de las células que expresan receptores de membrana, la hipótesis de que forma oligomérica homo-complejos. Mapas de la FRET eficiencia, son capaces de estimar la información sobre el complejo estequiométrico oligómero en estudio.
Other articles by Valerica Raicu on PubMed
Combinado Argatroban Y Edaravone Causados Neuroprotección Aditivo Contra 15 Minutos De Isquemia Cerebral Anterior En Jerbos
Hemos investigado si o no una combinación de inhibidor selectivo de la trombina, argatroban, y el captador de radicales libres, edaravone (MCI-186), mejora la hipoperfusión post-isquémica y disminuye la mortalidad después de 15 minutos de isquemia del cerebro anterior en el jerbo. Argatroban o edaravone solo aumentó significativamente el flujo sanguíneo cerebral post-isquémica y edema cerebral atenuada después de la reperfusión. Sin embargo, sólo la combinación de aumento de la proporción de supervivencia (p <0,05 en la de Mantel-Cox) y protegidos del daño de las células neuronales. El presente estudio indica que los anticoagulantes y eliminadores de radicales libres recíprocamente funcionar para inhibir la progresión del daño celular isquémico y que una combinación de estos tipos de medicamentos ayudará a mejorar los resultados después de la isquemia cerebral.
De Celda Oscura 'Causas De Isquemia Aguda De Cambio De Las Células Marginales Strial En La Cóclea Gerbil
La estría vascular coclear produce la endolinfa y genera el potencial de CC endococlear, dos ingredientes indispensables de un proceso de transducción auditiva. La célula marginal, uno de los varios tipos de células que constituyen la estría vascular, se denomina "la celda oscura 'sobre la base de su apariencia por microscopía electrónica de transmisión (TEM). Para aclarar si esto se observa comúnmente "aspecto oscuro" es una característica normal de las células marginales, como se conjeturó en la literatura, o un artefacto experimental, hemos desarrollado un método de fijación in vivo para minimizar los daños isquémicos tejidos. Mientras que en la circulación sistémica sostenida con sangre oxigenada, la estría vascular de los jerbos se fija químicamente por perfusión perilinfática con un fijador, y la estría vascular fue observada por TEM. En contraste con un número de informes anteriores, el citoplasma de las células marginales no era oscura, y el análisis cuantitativo mostró que la diferencia entre la densidad de electrones citoplásmica de las células marginales y la de las células intermedias (otro tipo de células strial) no fue estadísticamente significativa. Por comparación, los gerbos se permitió que someterse a 3 min de decapitación isquemia siguiente. Bajo estas condiciones, las células marginales mostró típico "oscuro apariencia ', como se informó anteriormente, y su densidad de electrones citoplásmica era 1,7 veces mayor que la de las células intermedias. Además, el volumen de las mitocondrias en las células marginales sometidos a 3 min de isquemia fue mayor que el fijado en vivo. Por lo tanto, la conclusión de que la apariencia de la ampliamente reconocida 'celda oscura' de las células marginales siguiendo los procedimientos convencionales de fijación refleja daño celular debido a la isquemia, que es inherente a los procedimientos de fijación estándar, pero se puede evitar la fijación de nuestro protocolo introduce aquí.
Interacción De La Proteína Cuantificada En Vivo Por Espectralmente Resuelta Transferencia Energía De Resonancia Fluorescente
Se describe una transferencia de energía resonante de fluorescencia (FRET)-basada método para encontrar en las células vivas de la fracción de una población de proteínas (alfa (T)) complejos de conformación, y el número medio (n) de las moléculas de proteína en cada complejo. El método se basa tanto en la emisión de aceptor sensibilizado y en donante de-enfriamiento (por photobleaching de las moléculas aceptoras), junto con un completo análisis espectral de la firma diferencial de fluorescencia, con el fin de cuantificar la transferencia de energía donante / receptor. Los límites de aproximación y la sensibilidad están bien adaptados para in vivo investigaciones microscópicas. Esto se demuestra mediante un microscopio de escaneo láser confocal para estudiar la formación del complejo de la proteína del receptor estéril 2 del factor alfa (Ste2p), con la etiqueta verde, cian y amarillo proteínas fluorescentes (GFP, CFP, y YFP, respectivamente), en la levadura Saccharomyces en ciernes cerevisiae. Un modelo teórico que se presenta se refiere la eficiencia de la transferencia de energía en las poblaciones de proteína (la aparente FRET eficiencia, E (ap)) a la energía transferida en una sola donante / aceptor de par (E, el verdadero FRET eficiencia). Se determinó E usando un nuevo método que se basa en la aplicación (E) las mediciones de dos donantes / aceptor de pares, y Ste2p-CFP/Ste2p-YFP Ste2p-GFP/Ste2p-YFP. Desde E (APP) y E se determinó alfa (T) de aproximadamente 1 y n de aproximadamente 2 por Ste2 proteínas. Dado que los complejos Ste2p se forman en la ausencia del ligando en nuestros experimentos, se concluye que la feromona del factor alfa no es necesario para la dimerización.
Determinación De La Energía De Enlace Fe-CO En El Uso De Mioglobina-heterodino Detectado Transitoria Fase Térmica Espectroscopia Rejas
Las energías de enlace en los sitios activos de las proteínas están íntimamente acoplado a la relación estructura-función en los sistemas biológicos. Debido a la naturaleza desconocida de la proteína de relajación a lo largo de una coordenada de reacción, no ha sido posible determinar directamente energías de enlace correspondientes a la función proteica. Al incorporar proteínas en gafas trehalosa, es posible congelar a cabo relajación proteína en escalas de tiempo cortos y determinar las energías de enlace de ligandos fotolábiles utilizando espectroscopía fototérmicos. Como un ejemplo prototípico, la dinámica fotodisociación y energética del carboxi-mioglobina (MbCO) en una matriz de vidrio trehalosa a temperatura ambiente fueron estudiados por absorción transitoria (o bomba-sonda) y espectroscopía transitoria térmica fase rejilla para determinar la dinámica de recombinación de CO y asociado energética, respectivamente. Ambos la energética iniciales de la ruptura de enlaces y la energía liberada en unión reformación podría ser utilizado, en una escala de tiempo más rápido que la relajación significativa de las proteínas, para determinar la energía de enlace Fe-CO como 34 + / - 4 kcal / mol. Esta energía de enlace es significativamente mayor que el citado general (25 kcal / mol) sobre la base de mediciones indirectas, pero está en buen acuerdo con las predicciones teóricas recientes (35 kcal / mol) (Rovira, C.; Parrinello, M. Int J. . Quantum Chem.. de 2000, 80, 1172). Este resultado, en combinación con el estudio teórico sugiere que la estructura de proteína juega un papel importante en las energías de enlace en los sitios activos que a su vez proporciona un elemento de ajuste de las alturas de barrera eficaces independientes a la región del estado de transición.
Eficiencia De La Transferencia De Energía De Resonancia De Los Complejos Oligoméricos Homo-de Las Proteínas
Un modelo teórico propuesto para la eficacia aparente de fluorescencia (Förster) la transferencia de energía de resonancia (FRET) en las mezclas de monómeros libres y la homo-oligómeros complejos de proteínas de tamaño uniforme. El modelo tiene en cuenta las posibles vías para la transferencia de las excitaciones ópticas de un solo donante a receptores múltiples y de múltiples donantes (no simultáneamente) a aceptadores individuales. Esta salida necesaria de la teoría estándar ha sido sugerido en la literatura, pero sólo se ha aplicado con éxito para unos pocos casos particulares, tales como para geometrías particulares de los oligómeros. Las predicciones del modelo teórico presente difieren significativamente de las de la teoría estándar, con la excepción del caso de dímeros, para lo cual se observa acuerdo. Este modelo por lo tanto proporciona nuevos conocimientos sobre el comportamiento FRET de oligómeros que comprenden más de dos monómeros, y también sugiere medios para determinar el tamaño de los complejos de proteínas oligoméricas así como la proporción de monómeros asociadas y no asociadas.
La Aplicación De Una Matriz Reconfigurable Rápido Para La Caracterización De Tejidos De Impedancia
Varias propiedades del tejido se han utilizado en las métricas pasados y presentes como que pueden servir para discriminar sano de tejido enfermo. La absorción electromagnética (de rayos X y las señales ópticas), la dispersión de la luz del infrarrojo cercano, y la impedancia eléctrica son unos pocos parámetros tales. Con el fin de servir como discriminantes para enfermos (por ejemplo, neoplásica) del tejido, las características de estos tejidos primero debe ser determinada con precisión. En este trabajo, consideramos que las propiedades de la impedancia eléctrica de los tejidos y los agregados de células, y presentar el diseño de un conjunto de electrodos reconfigurable que es capaz de proporcionar una interfaz electromagnética bien definida para el tejido en estudio, para la caracterización de la banda de 0,01 a 30 rango. La configuración de elementos de la matriz puede ser cambiado fácilmente bajo el control digital, lo que permite varias configuraciones del campo electromagnético que debe aplicarse al tejido bajo estudio. La matriz está diseñada para interfaz de cuatro puntos, así como instrumentación impedancia de dos puntos, y puede ser utilizada para los sistemas bioimágenes dos dimensiones sobre la base de impedancias eléctricas. El diseño puede hacerse a escala en las frecuencias más altas y más pequeñas dimensiones, lo que permite para los estudios de las propiedades eléctricas a nivel celular.
Monitorización En Tiempo Real De Los Dos Fotones Fotopolimerización Para Su Uso En La Fabricación De Dispositivos De Microfluídica
Se presenta un método mejorado para la producción de los maestros dispositivo de microfluidos con dos fotones fotopolimerización de SU-8 fotorresistencia negativa, que se basa en un microscopio de dos fotones (TPM) de uso común en las imágenes de muestras biológicas. Los maestros de dispositivos sirven como estructuras de alivio negativas para polidimetilsiloxano basados en dispositivos de microfluidos. Hemos observado que no sólo la excitación de dos fotones de la SU-8 fotorresistente iniciar la reticulación del material en la región del foco del haz de láser infrarrojo cercano (como se esperaba), pero también dio lugar a la emisión de fluorescencia en el visible rango. La emisión detectada de SU-8 fotorresistente experimentando dos fotones de excitación muestra una fuerte correlación con el tamaño de los objetos polimerizados producidos durante la exposición, lo que permitió el progreso del proceso de producción de microfluidos maestro a ser monitoreado en tiempo real. Se demuestra el uso de la detección por fluorescencia de dos fotones durante la fotopolimerización en la producción de dispositivos de microfluidos, que fueron diseñadas para atrapar las células individuales de levadura para obtener imágenes con el TPM mismo que se utiliza para la escritura maestra de microfluidos.
Tamaño Oligomérica Del Receptor Muscarínico M2 En Células Vivas Como Cuantitativa Determinada Por Transferencia De Energía De Resonancia Fluorescente
Resonancia de fluorescencia de transferencia de energía (FRET), medida por fluorescencia basada en la intensidad de la microscopía de fluorescencia y de imagen de por vida, se ha utilizado para estimar el tamaño de los oligómeros formados por la M (2) receptores colinérgicos muscarínicos. El método se basa en la relación entre la aparente FRET eficiencia dentro de un oligómero de tamaño especificado (n) y la eficiencia FRET pares entre un donante y un aceptor única (E). La M (2) del receptor se funden en el extremo N de la proteína verde fluorescente mejorada o amarillo y se expresa en células de ovario de hámster chino. Emisión espectros fueron analizados por deconvolución espectral, y eficiencias aparentes se calcularon por donante-aceptor dequenching y emisión sensibilizado a diferentes proporciones de mayor amarillo fluorescente proteína-M (2) del receptor para mejorar la proteína fluorescente verde-M (2) del receptor. Los datos fueron interpretados en términos de un modelo que considera todas las combinaciones de donador y aceptor dentro de un oligómero especificada para obtener valores ajustados de E como sigue: n = 2, 0,495 + / - 0,019, n = 4, 0,202 + / - 0,010; n = 6, 0,128 + / - 0,006, n = 8, 0,093 + / - 0,005. El pares FRET eficiencia determina de forma independiente por formación de imágenes vida de fluorescencia fue 0.20-0.24, la identificación de la M (2) del receptor como un tetrámero. La estrategia descrita aquí da una estimación explícita de tamaño oligomérica sobre la base de las propiedades de fluorescencia por sí solos. Su aplicación más amplia podría resolver la cuestión general de si el G receptores acoplados a proteínas existen como dímeros o más oligómeros. El tamaño de un oligómero tiene implicaciones funcionales, y esa información se puede esperar que contribuyen a una comprensión del proceso de señalización.
Dieléctrica De Dos Dimensiones De Espectroscopía: Implementación Y Validación De Un Microscopio De Barrido De Composición Abierta De La Sonda Coaxial
Espectroscopía dieléctrica es una poderosa herramienta para la caracterización y clasificación de materiales en función de sus propiedades eléctricas. Con el fin de realizar las mediciones dieléctricas en una muestra con propiedades espacialmente variable, la sonda de medida típico es reposicionado manualmente sobre la superficie de la muestra para cada medición. En este artículo se presenta una nueva técnica, basada en una amplia multielectrodo reconfigurable, lo que facilita el registro de las mediciones en diferentes localizaciones espaciales diferentes sin mover físicamente los electrodos de medición. Por electrónicamente seleccionando uno de los electrodos como la línea interna y la conexión del resto de los electrodos entre sí para formar la línea exterior, una sonda coaxial abierta se crea, que puede ser reposicionado simplemente seleccionando diferentes combinaciones de electrodos, de ahí el nombre de un "viajando" sonda coaxial. El factor geométrico, o la constante de celda, de cada sonda coaxial en la matriz se estimó a partir de mediciones en soluciones salinas con conocidas características eléctricas. Con el fin de validar la configuración para la medición de las propiedades dieléctricas de las células biológicas, la capacitancia de la membrana plasmática y la conductividad citoplasma de las células de levadura en suspensión en soluciones acuosas se mide y se compara con los resultados de los informes publicados. Dieléctrica espectroscopía de imagen se llevó a cabo en fantasmas tejidos hechos de un gel de agar con inclusiones que consisten en concentrados suspensiones de células de levadura. Las mediciones se realizaron en los fantasmas, y los datos dieléctricas fueron asignadas espacialmente con respecto a la localización de los electrodos. Los datos eléctricos espaciales correlacionados precisamente con la ubicación de las inclusiones celulares de levadura dentro de los fantasmas.
Comparación Entre Los Enfoques Integrales De Distribución Y Medio Basado En La Determinación De La Eficiencia De Transferencia De Energía De Resonancia De Fluorescencia En Los Conjuntos De Proteínas En Las Células Vivas
Los métodos actuales de análisis de datos procedentes de estudios de las interacciones proteína-proteína mediante la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) surgió de varias décadas de investigación que utilizan microscopios de campo amplio y espectrofluorómetros para medir la fluorescencia de las células individuales o poblaciones de células. Inherente a la mayoría de las mediciones es un promedio de las distribuciones de FRET eficiencias más grandes poblaciones de complejos de proteínas, que se lava a cabo información con respecto a la estequiometría y la estructura de los complejos de proteínas. A pesar de la introducción de sistemas de escaneo, microscopios, en principio, podría facilitar la cuantificación de la distribución de la eficiencia de FRET en células vivas, sólo hace relativamente poco tiempo se materialicen plenamente este potencial, a través del desarrollo de enfoques espectrales-o de por vida a base de. Para aprovechar esta nueva oportunidad en la proyección de imagen molecular, es necesario desarrollar modelos teóricos y métodos de análisis de datos. Usando simulaciones de Monte Carlo, se determinó la distribución espacial de FRET homogéneos y no homogéneos de las moléculas. Nuestros resultados indican que un análisis basado en la distribución de la eficiencia de FRET presenta importantes ventajas sobre el enfoque basado en promedio, que incluyen lo que permite la correcta identificación de FRET biológicamente relevantes. Este estudio proporciona información detallada sobre el efecto de la aglomeración molecular en el traste, y ofrece una base para la extracción de información de la distribución de la eficiencia de FRET mediante simulaciones basadas en datos de conexión.
