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Articles by Vanessa Auld in JoVE
JoVE General
Visualiser le Live Drosophile Gliales-jonction neuromusculaire avec des colorants fluorescents
Department of Zoology, University of British Columbia - UBC
Nous avons décrit les caractéristiques structurelles des synapses neuromusculaires Glia-dans un roman de préparation des tissus intérieur-extérieur de larves de mouches en direct en utilisant des colorants fluorescents en microscopie confocale. Nous avons étiqueté terminaisons neuronales vivre avec fluorescentes anticorps primaires à HRP, et également visualisé l'espace perisynaptic avec dextranes fluorescents.
Other articles by Vanessa Auld on PubMed
Migration Mésoderme établir Une Répartition Uniforme De La Laminine Dans Le Développement De L'embryon Grasshopper
La lame basale est composée de molécules qui interagissent physiquement pour former un réseau qui sert de migrationnelle échafaudage pour de nombreux types cellulaires. Dans le développement du système nerveux périphérique de la sauterelle, des cônes de croissance neuronaux sont intimement associés à la lame basale lors de leur migration. La laminine est une composante majeure de la lame basale et est un promoteur puissant de la croissance des neurites in vitro. Toutefois, il n'est pas clair quelle est la source de la laminine, ou comment la distribution de la laminine dans la membrane basale est établie. Pour répondre à cette question, les gènes de sauterelles sous-unités de laminine ont été clonés. Comme prévu, la laminine a été trouvée dans la lame basale dans tout l'embryon, en particulier dans l'oeuf branche, où l'expression est confondu avec l'excroissance et le guidage des neurones tibiales pionnières (TIL). Étonnamment, la synthèse de chaînes bêta et gamma de la laminine a été limitée à migratoires cellules mésodermiques, tandis que dans d'autres tissus non migrateurs, tels que l'épithélium et le muscle présomptif, bêta et gamma des chaînes de la laminine n'ont pas été détectés. En dépit de cela, la laminine immunoréactivité dans la lame basale apparaît uniforme et est disponible en tant que substrat pour la croissance axonale.
Fire Exit Est Un Potentiel Quatre Protéine Transmembranaire Exprimée Dans Le Développement Chez La Drosophile Glia
Glia de nombreux organismes divers jouer un certain nombre de rôles importants au cours du développement du système nerveux. Par conséquent, connaissant les molécules qui contrôlent la fonction des cellules gliales fera progresser notre compréhension des mécanismes qui contrôlent le développement du système nerveux. Nous avons isolé un nouveau gène chez Drosophila melanogaster, qui s'exprime dans un sous-ensemble de la glie périphérique. Nous appelons ce gène "sortie de secours" (FIE), que les cellules gliales qui expriment ce gène ne sorte à un moment où ils marquent le point d'entrée et de sortie des axones dans les systèmes CNS / PNS limites. Ce sous-ensemble de l'acte glie périphérique en tant que cibles intermédiaires au cours de pathfinding et la migration des axones sensoriels en particulier. Sortie de secours a été cloné et j'ai trouvé pour coder une protéine transmembranaire roman. Sortie de secours appartient à un groupe de protéines identifiées dans le Drosophila melanogaster et Anopheles gambiae bases de données qui contiennent quatre domaines transmembranaires prédits et un motif commun intracellulaire. Les mutations qui éliminent la protéine issue de secours n'ont pas la perturbation évidente de la fonction des cellules gliales. D'autre part, la glie exprimant le gène de pont Feu de sortie de la zone de transition entre SNC et du SNP et de jouer un rôle dans le guidage axonal sensorielle. Par conséquent, il apparaît que, tandis que les cellules gliales qui expriment cette protéine médiate guidage axonal, sortie de secours elle-même joue un rôle non essentiel dans cette fonction. Un rôle pour la sortie d'incendie dans le développement gliales peuvent être suggérés par sa relation évolutive à une famille de protéines associées aux lysosomes appelés LAPTMs et suggère que la sortie incendie, il peut fonctionner dans le transport intracellulaire au cours du développement des cellules gliales.
GTPases RhoA Et Rac1 Médiation Sur Les Restructurations Dynamique De L'actine Dans Les Cellules Gliales Périphériques
Périphériques des cellules gliales dans les deux vertébrés et les insectes naissent au niveau central et parcourir de grandes distances à ensheathe axones dans la périphérie. Il est très peu connu sur la façon dont cette migration est effectuée. Dans d'autres cellules, il est connu que le réarrangement du cytosquelette d'actine est une partie intégrante de la motilité cellulaire, mais la distribution de l'actine dans la migration cellulaire gliale périphérique in vivo n'a pas été préalablement caractérisés. Pour acquérir une compréhension de la façon dont la glie migrent, nous avons expressément marqué la glie périphérique de Drosophila melanogaster en utilisant un marqueur actine-GFP et analysé leur développement dans le SNP embryonnaires. Il a été constaté que cytosquelette d'actine est réarrangé de façon dynamique lors de la migration des cellules gliales. La glie périphérique ont été observés à migrer comme une chaîne continue de cellules, avec les cellules gliales de premier plan figurant à participer à la plus grande mesure à explorer les environs extracellulaires avec filopodes-comme des projections d'actine contenant. Nous émettons l'hypothèse que la petite GTPases Rho, Rac et Cdc42 sont impliqués dans les réarrangements du cytosquelette d'actine qui sous-tendent la migration périphérique gliale et ensheathement nerf. Pour tester cette hypothèse, les formes transgéniques des GTPases ont été exprimés de manière ectopique spécifiquement dans les cellules gliales périphériques lors de leur migration et les phases d'emballage. Les effets sur les cellules gliales actine-GFP distribution et les effets globaux sur la migration des cellules gliales et le développement morphologique ont été évalués. Nous avons constaté que RhoA et Rac1 ont des rôles distincts dans la migration cellulaire périphérique gliale et ensheathement nerf, mais, Cdc42 ne jouent pas un rôle significatif dans le développement gliale périphérique. RhoA et Rac1 gain de fonction et la perte de fonction des mutants avaient à la fois la perturbation du développement des cellules gliales et les effets secondaires sur fasciculation axone sensoriel. Ensemble, l'actine du cytosquelette dynamique est une partie intégrante de la migration gliale périphérique et ensheathement nerf, et est médiée par RhoA et Rac1.
Gliotactin, Un Nouveau Marqueur De Jonctions Tricellulaire, Est Nécessaire Au Développement Junction Cloisonnées Chez La Drosophile
Cloisonnées jonctions (JS), semblable à jonctions serrées, fonctionnent comme des barrières de perméabilité transépithéliaux. Gliotactin (Gli) est une molécule de la cholinestérase, comme ce qui est nécessaire pour l'intégrité barrière hémato-nerveuse, et peut, par conséquent, contribuer au développement SJ ou une fonction. Pour répondre à cette hypothèse, nous avons analysé l'expression et la Gli Gli phénotype mutant chez la drosophile épithéliums. Chez les mutants Gli, la localisation de marqueurs SJ neurexine-IV, disques grande, et coracle sont perturbés. En outre, la fonction de barrière SJ est perdu tel que déterminé par des tests de perméabilité de teinture. Ces données suggèrent que Gli est nécessaire pour la formation de SJ. Étonnamment, la distribution Gli colocalise seulement avec des marqueurs SJ autres au niveau des jonctions tricellulaire, ce qui suggère que Gli a une fonction unique dans le développement SJ. L'analyse ultrastructurale de Gli mutants appuie cette notion. Contrairement à d'autres mutants SJ dans lequel cloisons sont manquantes, cloisons sont présents dans des mutants de Gli, mais la jonction a une morphologie immature. Nous proposons un modèle, lequel agit au niveau des jonctions Gli tricellulaire à lier, d'ancrage, ou compacts brins SJ apicalement au cours du développement SJ.
Interactions Réciproques Entre Neurones Et Cellules Gliales Sont Nécessaires Pour La Drosophile Développement Du Système Nerveux Périphérique
Un rôle majeur de développement de la glie périphérique est de servir de médiateur guidage axonal sensorielle, mais on ne sait pas si les neurones sensoriels influencent le développement périphérique des cellules gliales. Pour déterminer si la glie et les neurones interagissent réciproquement au cours du développement embryonnaire, nous avons une ablation chaque type de cellule par surexpression du gène apoptose, sombre, et observé les effets sur le système périphérique (SNP) de développement nerveux. Lorsque les neurones sont une ablation, les défauts se produisent gliales comme un effet secondaire, et vice-versa. Par conséquent la glie et les neurones sont interdépendants cours de l'embryogenèse. Pour explorer davantage gliales-neuronales des interactions, nous avons perturbé la migration génétiquement gliales ou de la différenciation et a observé les effets secondaires sur le développement des neurones sensoriels. La migration et de cellules gliales ensheathment des axones du SNP a été bloqué par la surexpression de Rho GTPase activée, un régulateur de la dynamique de l'actine. Ici, les axones sensoriels étendu aux CNS, sans présenter de graves erreurs de pathfinding. En revanche, ce qui perturbe la différenciation par l'expression de dominant négatif de Ras GTPase dans la glie ont entraîné d'importantes erreurs sensorielles pathfinding axone, semblables à ceux observés dans les ablations gliales. Surexpression Glial de composants transgéniques du facteur de croissance épithélial de voie (EGFR) de signalisation cédé similaires défauts neurones sensoriels et aussi une régulation négative de l'expression du marqueur glial Neuroglian. Analyse de mutants a également suggéré que l'EGFR ligands Spitz et jouent des rôles dans le développement des veines gliale périphérique. Les observations confirment un modèle dans lequel la glie exprimer des gènes nécessaires au développement des neurones sensoriels, et que ces gènes sont potentiellement sous le contrôle de la voie EGFR / signalisation Ras.
Le Domaine Intracellulaire De La Drosophile La Cholinestérase Comme Protéine D'adhésion Neurale, Gliotactin, Est Natif Déplié
Drosophila gliotactin (Gli) est un 109-kDa transmembranaire, la molécule d'adhésion de la cholinestérase, comme (CLAM), exprimée en cellules gliales périphérique, qui est cruciale pour la formation de la barrière hémato-nerveuse. La partie intracellulaire (Gli-cyt) a été cloné et exprimé dans la fraction cytosolique de Escherichia coli BLR (DE3) à 45 mg / L et purifié par Ni-NTA (acide nitrilotriacétique) chromatographie. Bien que la migration sur gel d'électrophorèse de sodium dodécyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE), dans des conditions dénaturantes, était anormalement lent, la détermination du poids moléculaire par désorption laser assistée par matrice / ionisation de temps de vol (MALDI-TOF) spectrométrie de masse (MS) confirmé que le produit était conforme à sa taille théorique. Chromatographie de filtration sur gel a abouti à un rayon de Stokes anormalement élevée, suggérant une conformation complètement dépliée. Le dichroïsme circulaire (CD) ont démontré que la spectroscopie Gli-cyt était> 50% déplié, suggérant en outre une conformation nonglobular. Enfin, 1D-(1) H RMN démontré de façon concluante que Gli-cyt possède une structure étendue dépliée. En outre, Gli-cyt a été démontré qu'ils possèdent de charge et des propriétés hydrophobes caractéristiques des protéines dépliées nativement (c.-à-protéines qui, une fois purifié, sont intrinsèquement désordonnés dans des conditions physiologiques in vitro).
Transient Polarisation Apicale De Gliotactin Et Coracle Est Requis Pour L'alignement Parallèle Des Poils Wing Chez La Drosophile
Chez la drosophile, les poils des ailes sont alignés dans une distalement orientée, réseau parallèle. La voie crépus détermine la polarité cellulaire proximale-distale dans l'aile, mais, chez les mutants de la voie frizzled, poils d'ailes restent parallèles. Comment aligner les poils des ailes n'a pas été déterminée. Nous avons démontré un nouveau rôle pour l'Gliotactin cloisonnées protéines de jonction (Gli) et Coracle (Cora) dans ce processus. Avant l'extension prehair, Gli et Cora ont été limitées à membranes basolatérales. Au cours de pupe prehair développement, Gli et Cora transitoirement formé rubans apicales orientés à partir de l'extrémité d'aile distale à l'articulation proximale. Ces rubans ont été alignés sous des bases prehair et a persisté pendant plusieurs heures. Pendant ce temps, Gli a été perdu entièrement le domaine basolatéral. Une mutation Gliotactin modifié la polarisation apicale Gli et Cora et les défauts induits dans l'alignement des cheveux dans pupal et adulte. Génétiques et de la cellule des dosages biologiques ont démontré que Gli et Cora fonctionner pour aligner les poils indépendamment de crépus. Pris dans leur ensemble, nos résultats indiquent que Gli et la fonction Cora que les membres du premier identifiés d'un long prédit, crépus mécanisme indépendant d'alignement parallèle. Nous proposons un modèle dans lequel la polarisation apicale de Gli et les fonctions Cora à stabiliser et à aligner prehairs par rapport à des frontières des cellules antéro-postérieures au cours du développement nymphal aile.
Signalisation Dans Le Développement Gliale: Migration De Différenciation Et D'orientation Axon
Les cellules gliales ont des fonctions diverses qui sont nécessaires pour le bon développement et la fonction de systèmes nerveux complexes. Au cours du développement, une variété de réciprocité des interactions entre cellules gliales et de signalisation des neurones dicter toutes les parties du développement du système nerveux. Glia peut fournir des indices intéressants, répugnant, ou contactez-médiation pour orienter les cônes de croissance neuronaux et s'assurer que les neurones trouvent leurs cibles appropriées synaptiques. En fait, les deux neurones et cellules gliales peuvent agir en tant que substrats migratoires pour l'autre à différents moments au cours du développement. En outre, l'échange de signaux entre les cellules gliales et trophiques des neurones est essentielle pour le regroupement proprement dit, fasciculation, et ensheathement des axones ainsi que la différenciation et la survie des deux types de cellules. Le nombre croissant de liens entre cellules gliales et dysfonctionnement maladie humaine a suscité un grand intérêt en biologie des cellules gliales. En raison de sa relative simplicité et les nombreux outils de génétique moléculaire disponibles, la drosophile est un excellent modèle pour étudier le développement des cellules gliales. Cet examen donnera un aperçu des rôles de la glie et leurs interactions avec les neurones dans le système nerveux embryonnaire de la mouche.
Evolution De Palourdes (molécules D'adhésion De La Cholinestérase Comme): Structure Et Fonction Au Cours Du Développement
La famille de protéines connue sous le nom palourdes (molécules d'adhésion de la cholinestérase comme) forme une nouvelle classe de protéines d'adhésion cellulaire hétérophiles. Membres de la famille se trouvent à travers un large éventail de métazoaires et de jouer un rôle lors de l'élaboration des tissus multiples. La majorité des membres de cette famille sont des protéines transmembranaires avec un domaine extracellulaire qui est conservée avec les cholinestérases, y compris l'acétylcholinestérase. Pourtant, tous les membres de la famille n'ont pas une ou plusieurs des résidus qui forment la triade catalytique nécessaire à la fonction enzymatique. Par conséquent, la cholinestérase conservé domaine de type n'est pas nécessaire pour la fonction enzymatique, mais ne semble pas jouer un rôle dans la liaison hétérophiles. PALOURDES sont exprimés dans un large éventail de tissus et de la plupart des membres de la famille semblent jouer un rôle dans l'adhésion cellulaire et la formation de jonction. Le développement de jonctions, y compris jonctions septées et jonctions synaptiques nécessitent membres de la famille CLAM comme Gliotactin et neuroligines respectivement. Modélisation du domaine de la cholinestérase, comme révèle que les changements évolutifs à la poche de liaison du domaine cholinestérase peut produire un éventail de partenaires différents ligands de liaison pour membres de la famille CLAM. Dans cette veine, les travaux antérieurs chimère expériences et récente a identifié des mutations dans CLAM membres de la famille qui affectent la structure du domaine de la cholinestérase, comme. Ces formes mutantes affectent la fonction des protéines au cours du développement de jonctions spécialisées et de confirmer le rôle du domaine de la cholinestérase dans la médiation contraignant hétérophiles.
Rôles De La Glie Dans Le Système Nerveux Chez La Drosophile
Les cellules gliales ont des fonctions diverses qui sont nécessaires pour le bon développement et la fonction de systèmes nerveux complexes. Divers insectes, principalement la mouche Drosophila melanogaster et le papillon Manduca sexta, ont fourni des modèles utiles de la fonction gliale au cours du développement. La présente revue présentera des preuves de contributions gliales à embryonnaire, visuelle, olfactive et le développement de l'aile. Nous allons également présenter une preuve en cas de non-développement des fonctions de la glie insectes y compris le sang-encéphalique formation, les fonctions homéostatiques et les contributions potentielles à la fonction synaptique. Le cas échéant, nous allons également souligner les similitudes entre les fonctions de la glie insectes et leurs homologues vertébrés.
Gliotactin Et Disques Grande Forme Un Complexe Protéine à La Jonction De Tricellulaire Cellules épithéliales Polarisées Chez La Drosophile
La jonction tricellulaire (TCJ) se forme à la convergence des jonctions septées plissés (SJS) de trois cellules adjacentes dans les épithéliums polarisés et est nécessaire pour maintenir la barrière transépithélial. Chez la drosophile, la protéine transmembranaire Gliotactin était le premier marqueur de la TCJ identifiés, mais peu est connu sur d'autres constituants moléculaires. Nous montrons maintenant que les associés Gliotactin avec disques de grandes à la TCJ dans un Ca (2 +) de manière dépendante. Disques de grandes est essentiel pour la formation de la TCJ et la localisation de Gliotactin. Étonnamment, la localisation Gliotactin à la TCJ était indépendante de sa PDZ motif de liaison et Gliotactin ne se lie pas directement à disques de grande taille. Par conséquent Gliotactin et disques association est grande grâce à des protéines intermédiaires à la TCJ. Gliotactin peut s'associer avec d'autres protéines de jonction cloisonnées, mais cela a été détectée que lorsque Gliotactin a été surexprimée et se propager dans le domaine de jonction cloisonnées. Surexpression Gliotactin et de diffuser également entraîné une réduction de la coloration disques importante, mais pas vice-versa. Ces résultats suggèrent que les disques de grandes participe à différentes interactions entre protéines dans le SJ et le TCJ. Enfin ce travail supporte un modèle dans lequel Gliotactin et Dlg sont des composants d'un complexe protéine plus grande qui relie les JS convergentes avec le TCJ pour créer la barrière transépithélial.
No Pun Intended: Orientations Futures De La Invertébrés Gliales études Sur Les Migrations Cellulaires
Les cellules gliales jouent un large éventail de rôles essentiels dans les deux développement du système nerveux et la fonction et a été examiné récemment (Parker et Auld, 2006). Glia fournir une gaine isolante, la forme ou diriger la formation de la barrière hémato-encéphalique, contribuent à l'homéostasie des ions et des métabolites et fournir des signaux de guidage. Fonction gliale dépend souvent de la capacité des cellules gliales à migrer vers des endroits précis au cours du développement du système nerveux. Travailler dans le développement du système nerveux chez les insectes, en particulier dans la mouche Drosophila melanogaster et le sphinx du tabac Manduca sexta, a permis de mieux comprendre les rôles de la glie, bien que les mécanismes moléculaires sous-jacents la migration des cellules gliales sont déterminés seulement maintenant. En effet, bon nombre des processus et des mécanismes découverts dans ces systèmes plus simples ont des parallèles directs dans le développement de systèmes nerveux des vertébrés. Dans cette revue, nous examinons d'abord les contextes de développement dans lequel la migration des invertébrés cellules gliales a été observée, nous avons ensuite discuter des molécules caractérisées requises pour la migration des cellules gliales bon, et nous avons finalement discuter des objectifs futurs à être abordés dans l'étude du développement des cellules gliales.
Contrôle De La Localisation Et Les Niveaux De Gliotactin Par Phosphorylation Sur Tyrosine Et Endocytose Est Nécessaire à La Survie Des épithéliums Polarisés
La jonction tricellulaire (TCJ) se forme à la convergence des jonctions bicellulaires de trois cellules adjacentes dans polarisée épithéliums et est nécessaire pour maintenir la barrière transépithélial. Dans la drosophile mouche des fruits, du TCJ est générée au point de rencontre des jonctions septées bicellulaires. Gliotactin fut le premier élément identifié de la TCJ et est nécessaire pour TCJ et le développement de jonction cloisonnées. Gliotactin est un membre de la famille des neuroligines et associés avec les disques de grandes protéines PDZ. Au-delà de cette interaction, on sait peu sur les mécanismes sous-jacents et de la fonction de localisation Gliotactin au TCJ. Dans cette étude, nous montrons que Gliotactin est phosphorylée au niveau des résidus tyrosine conservés, un processus nécessaire pour l'endocytose et le ciblage pour endosomes tardifs et les lysosomes de la dégradation. Règlement des niveaux de phosphorylation par Gliotactin et l'endocytose est nécessaire que les résultats surexpression dans le déplacement de Gliotactin loin de la TCJ l'ensemble du domaine de jonction cloisonnées. Gliotactin excessive dans les épithéliums polarisés conduit à la délamination, jumelé avec la migration ultérieure, et l'apoptose. L'apoptose et la prolifération résultant compensatoire résultant de hauts niveaux de Gliotactin sont médiés par la voie JNK chez la drosophile. Par conséquent, les niveaux Gliotactin dans la membrane cellulaire sont réglementés afin d'assurer la localisation correcte des protéines et la survie cellulaire.
Les Intégrines Sont Nécessaires Pour Le Développement Et L'entretien Des Couches Gliales Dans Le Nerf Périphérique Chez La Drosophile
Le développement du système nerveux périphérique comprend plusieurs classes de la glie qui coopèrent pour former des couches qui se chevauchent gliales jumelés avec le dépôt d'une matrice extracellulaire environnante (ECM). La formation de cette structure tubulaire protège les axones enveloppée de dommages physiques et pathogènes et de changements dans l'environnement ionique. Les intégrines, une grande famille de récepteurs ECM, jouer un certain nombre de rôles dans le développement de myélinisation des cellules de Schwann, une classe de cellules gliales engainantes les nerfs périphériques de vertébrés. Toutefois, l'identité et le rôle des complexes intégrines utilisés par les autres classes de la glie du nerf périphérique n'ont pas été déterminées chez un animal. Ici, nous montrons que, dans les nerfs périphériques de Drosophila melanogaster, deux complexes d'intégrine (αPS2βPS et αPS3βPS) sont exprimés dans les différentes couches gliales et des complexes d'adhésion avec la forme kinase liée aux intégrines et Talin. Knockdown de la sous-unité bêta commune (βPS) en utilisant l'ARNi inductible dans tous les résultats des cellules gliales dans la létalité et les défauts gliales. Analyse de l'intégrine fonction complexe dans certaines couches gliales ont montré que la perte de βPS dans la couche la plus externe (la glie perineurial) en résulte un échec pour envelopper le nerf, un phénotype similaire à celui de Matrix metalloproteinase 2-médiée la dégradation de la MEC. Knockdown de βPS intégrine dans les cellules gliales emballage intime entraîne une perte de processus gliales autour des axones. Ensemble, nos données suggèrent que les intégrines sont employés dans les différentes couches gliales pour arbitrer le développement et la maintenance de la gaine de protection gliales dans les nerfs périphériques chez la drosophile.
