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Articles by Vladimir J Kefalov in JoVE
JoVE General
单从小鼠锥感光细胞吸录音
我们将展示如何从单一的鼠标采用吸电极锥记录闪光的反应。
Other articles by Vladimir J Kefalov on PubMed
打破共价键 — — 色素的属性，有助于在锥脱敏。
视网膜杆和锥颜料包含载脂蛋白、 细菌视紫红质，共价键相连发色团，11 独联体视网膜。我们在这里展示的共价键之间细菌视紫红质的形成和 11 独联体视网膜是可逆在两栖类动物红锥，黑暗中，但本质上是不可逆转的红棒。这离解，显然一般财产的锥状色素，结果数量惊人的免费细菌视紫红质约 10%的总细菌视紫红质 — — 暗红色锥内。我们将这一重大级别的免费细菌视紫红质归低浓度的视网膜细胞内的自由 11 独联体，估计要红锥中的色素含量只有一小部分 （约 0.1%）。其本构 transducin 刺激的活动，免费锥细菌视紫红质生产大约二折脱敏红锥，相当于产生的稳定灯光造成 500 photoisomerizations s-1 中。锥色素分离因此有助于灵敏度棒和锥状细胞之间的差异。
短波信号传输性能锥视觉色素和在 Phototransduction 中的作用。
虽然视觉颜料在感光细胞中发挥了关键的结构和功能作用，那些哺乳动物锥和哺乳动物锥状色素的属性之间的关系不是很了解。我们将转基因小鼠生成带有棒表示鼠标的短波锥细菌视紫红质 (S-左） 来测试是否锥色素为视紫红质的结构和功能作用可以替代并调查生物物理和信号转导的短波锥色素 (S-色素） 属性如何贡献锥的专门功能。转基因 S 细菌视紫红质面向杆外段，并形成峰值吸收颜料在 360 牛米。S-细菌视紫红质缺乏视紫红质的棒中表达 （rho-/-) 促进外部分生长和细胞生存和恢复它们能够对光做出响应，同时将其行动谱转移到 355 nm。我们使用 S 色素与视紫红质的光谱分离，发现两个颜料制作类似的光。暗噪音没有转基因棒，指示 S 色素的热激活可能无助于鼠标 S 锥低灵敏度相对增加。使用 arrestin 敲动物杆 (arr1-/-），我们发现，生理活性 (元二) 状态的 S 色素衰变视紫红质的 40 倍。有趣的是，杆 arrestin 中停用 S 颜料棒，效率很高，但其删除锥内没有任何效果明显 dim flash 响应堵。此外，转基因锥 arrestin 没有能够拯救 arr1/棒 S 色素 dim flash 反应慢堵。因此，锥杆/arrestins 和 S 色素堵之间的连接仍然不清楚。
Intra-retinal 视觉周期所需的快速和完整的锥暗适应。
白天视野被介导的视网膜视锥，这与不同的棒，仍正常工作，即使在明亮的灯光和 dark-adapt 迅速。这些锥属性启用其色素的快速再生的。这反过来要求由规范的视网膜色素上皮细胞视觉周期不能实现快速发色团的回收利用。最近的生化研究表明存在第二个锥特定的视觉周期，虽然其生理功能，仍然是建立。我们发现蝾螈神经视网膜 Müller 细胞促进特定锥的色素再生和暗适应的色素上皮细胞无关的。这条路没有暗适应的锥状细胞是缓慢和不完整。值得注意的是，锥率色素再生的视网膜和色素上皮细胞视觉周期基本上相同，暗示可能共同速率限制步骤。最后，我们还注意到在孤立的鼠标视网膜锥暗适应。
基本和协同作用的 RP1 和 RP1L1 在杆感光器 Axoneme 和视网膜色素变性。
视网膜色素变性 1 (RP1) 是共同继承视网膜病变与变量发病和严重性。RP1 基因对含 doublecortin (DCX) 域特定的感光器、 微管相关的睫蛋白进行编码。在这里我们展示在小鼠中的，另一个感光器特定 Rp1 样蛋白 (Rp1L1) 也会已本地化为外段 (OSs) 和连接杆感光细胞纤毛，重叠与 Rp1.Rp1L1-/-小鼠显示分散 OS 解体、 减少视网膜电图振幅和逐步的光感受器变性，较不严重和 Rp1/小鼠比慢 axoneme。在单棒的 Rp1L1-/-，光敏性是减少，类似于 Rp1-/-。虽然个别杂合子是正常的 Rp1 和 Rp1L1 双杂合子表现出异常的 OS 形态和减少单个杆感光和暗电流。视网膜电图振幅的双重杂合子是更减少比那些个别杂合子相结合。在支持，Rp1L1 与 Rp1 转染细胞和视网膜拉下实验中进行交互。有趣的是，phototransduction 动力学是在单棒和整个视网膜的单个或双 Rp1 和 Rp1L1 基因突变小鼠正常。在一起，Rp1 和 Rp1L1 发挥影响感光和 OS 的杆感光细胞的形态发生中的重要和协同作用。我们的研究结果表明 RP1L1 基因突变可能造成视网膜病变或修改 RP1 病在人类中的表达。
替代途径介导的小鼠和人类锥视觉周期。
人类视觉系统的根本奥秘之一是锥体感受器的连续函数在明亮的日光之下。视觉色素被毁掉，或漂白，光，锥状细胞需要其快速的再生，转而牵涉到快速循环再用的颜料的发色团。杆和锥颜料的典型视觉周期涉及到回收的全反式视黄醇 11 独联体视网膜色素上皮细胞，毗邻感受器中向其发色团。然而，此途径的缺点表明第二次的锥特定、 发色团回收机制的功能。事实上，较低的物种的生理生化研究描述了除了长已知色素上皮细胞通路的锥特定视觉周期。两个重要问题仍然存在，但是： 这条步道的哺乳动物圆筒，函数中的作用是什么，目前在更高级的哺乳动物，包括人类吗？在这里，我们显示鼠标、 灵长类动物和人类神经视网膜促进色素再生和暗适应有选择性地在圆筒，但不是在棒。这条步道支持快速暗适应的哺乳动物锥和扩展其在背景光独立色素上皮细胞中的动态范围。这种色素再生机制是必要条件我们白天的愿景，似乎进化保守。
功能互换性杆和锥 Transducin α-亚基。
杆和锥体感受器使用类似，但不同组的 phototransduction 蛋白质分别实现不同的功能特性，适合于其作为 dim 和明亮的光受体的作用。例如，杆和视觉锥颜料为不同款式的 heterotrimeric G 蛋白 transducin 夫妇。然而，未知杆和锥 transducin alpha 亚基 (Talpha) 在确定杆和锥状细胞之间的功能差异之间的结构差异的作用。为了解决这一问题，我们研究了移位和信号杆锥和锥表示 Talpha 的属性 Talpha 表示在三个小鼠品系中棒： 杆 Talpha 挖空、 锥 Talpha GNAT2(cpfl3) 的突变种和杆和锥 Talpha 双突变体 rd17 鼠标。奇怪的是，虽然杆/锥 Talpha 只有 79%完全相同，外部表示杆或锥 Talpha 本地化和向每个感光器类型中的内源性 Talpha 相同再转移。此外，外部表示杆或锥 Talpha 救出视网膜电图 （ERGs） 小鼠应答缺乏功能性圆锥或杆 Talpha，分别。Ex 体内 transretinal ERG 和单个单元格录制从 rd17 视网膜杆或锥 Talpha 治疗表明可比杆灵敏度和反应动力学。这些结果表明，锥 Talpha 窗体功能 heterotrimeric G 蛋白复合物在棒和那杆和锥 Talpha 对夫妻同样很棒 phototransduction 级联。因此，杆与锥 transducin α-亚基都功能上可互换，其信号传输属性不助长棒和锥状细胞之间的内在的光敏感度差异。此外，在这里使用的技术可以调整为所需的任何此类同系物交换。
G 蛋白偶联受体激酶 1 (Grk1) 的影响过度表达对杆光感受器细胞活性。
感光器视紫红质激酶 (Rk，G 蛋白依赖受体激酶 1 [Grk1]） phosphorylates 光活化绿光更与渠道他们到 visual arrestins 的非活动配合。Grk1 虚导致人类视网膜病变和光致光感受器细胞死亡的鼠标高度的敏感性。这项研究的目标是确定是否过剩 Grk1 活性是保护对感光细胞死亡。
生理研究细菌视紫红质和中杆和锥视觉颜料的发色团之间的相互作用。
在脊椎动物的感光细胞中的视色素是 G 蛋白偶联受体蛋白质、 细菌视紫红质，共价键的发色团，由组成 11-独联体-视网膜。光的视色素激活触发产生感光细胞实验可衡量电反应的转导梯级。与完整的两栖类和鼠标杆和锥光感受器细胞中 electrophysiologial 录制，可以调查细菌视紫红质与发色团之间的相互作用。在这里我们介绍的方法为代以本机发色团与各种发色团类似物，调查如何具体部件的发色团影响视觉素的信号性质和视网膜感光细胞的功能。我们还介绍基因代以本机杆细菌视紫红质基因与锥绿光更或突变杆绿光更调查，并比较其信号的属性与方法。这些方法是很有用的不仅对理解视觉颜料的属性与类光感受器的功能之间的关系对于了解杆细菌视紫红质的突变产生夜盲和其他视觉障碍的机制。
与年龄相关的杆视觉在小鼠中恶化。
即使是健康的人在老化导致视力、 对比敏感度、 视野、 暗适应的恶化。驾驶年龄相关的视网膜和，更具体地说，感光细胞的变化的神经机制了解甚少。根据一个假说，杆功能与年龄相关的恶化是由于有限 11-独联体-视网膜杆色素形成。确定如何老化影响杆感受器和测试维甲酸缺假设，我们比较棒成人的形态和功能属性，并且岁 B6D2F1/J 小鼠。我们发现 2.5 岁小鼠与 4 月龄动物相比大大减少棒的数量和其外的线段的长度。老化还导致细菌视紫红质在视网膜中的总体水平减少了两个方面。行为的测试结果表明暗视力和对比敏感度下跌双重老年小鼠和杆 ERG 录音表明减少的振幅的两个 a-和 b-波。老年棒从单细胞的录音中确定的敏感性也减少了 1.5-fold，对应以不多于 1%无细菌视紫红质在这些感受器，dim 闪存反应动力学参数都不会改变。值得注意的是，按年龄的杆暗适应率并没有受到影响。因此，我们的研究结果在 B6D2F1/J 鼠标杆视觉周期中反对 11-独联体-视网膜与年龄有关虚证。奇怪的是，老年棒，提供一种替代机制为其脱敏中增加的蜂窝暗噪音水平。
膜锚固亚基指定 RGS9· 选择性调节Gbeta5 差距在感光器神经元复杂。
RGS9·Gβ5 复杂的神经元 G-蛋白信号转导的关键调节器，显示了非凡的亚基组成的选择性。在视网膜感光细胞，RGS9·Gβ5 绑定到膜锚 R9AP 和复杂调节视觉信号。中的基底神经节的神经元，RGS9·Gβ5 相反是同源的蛋白，R7BP，与相关联，并规定奖励电路。切换此选择性亚单位组成的复杂杆感受器，使我们能够在不同的 G 蛋白通路信号特异性的分子基础的研究中。我们发现这两个膜锚固亚基发挥守恒的作用，调节蛋白水平的 RGS9·Gβ5 和 RGS· 的能力加强Gβ5 配合物刺激蛋白 G 蛋白的活性。然而，或者配置配合物的亚细胞靶存在显著差异。与不同的是 R9AP，它依赖于被动的定向机制，运送到视网膜感光细胞的外段，R7BP 被排除在此位置和相反专门针对等离子膜。R7BP 包含配合物可外的群体，他们在哪里能够由来自视紫红质的活动目标信号调节的 phototransduction 级联重新路由。这些研究结果说明 RGS· G-蛋白信号转导调节的多样性Gβ5 配合物膜锚微分招募所取得。
锥特定视觉周期。
锥体感受器调解我们白天视觉和明亮和迅速变化的光照条件下的功能。他们视色素是调亡的过程中被毁，锥的连续函数规定需要快速回收其发色团和其色素的再生。视网膜色素上皮细胞规范维甲酸视觉循环回收发色团和用品它棒和锥状细胞。然而，这个途径，包括与发色团，棒的竞争及其速度很慢的缺点导致锥可能使用一个单独的机制，供循环再用的发色团的建议。在过去四年中已确定生化研究酶活性与回收视网膜锥主导的动物，如鸡和地面松鼠的发色团相一致。这些研究导致了锥特定视网膜视觉周期的假说。这些研究的生理意义引起了争议，很长时间和证据这一视觉周期函数只有在最近的研究中出现并将是这次审查的重点。视网膜视觉周期用品发色团和促进色素再生只锥中但不是在棒。这条步道是独立的色素上皮细胞，而是涉及到在其中发色团是循环再用，有选择性地提供给锥状细胞、 视网膜 Müller 细胞。发色团通过视网膜视觉周期快速供应是关键的扩展动态范围的明亮光线锥后的光线照射其快速暗适应。视网膜视觉周期的重要性是通过演变及其保护的还强调，作为其功能现在已表明物种从蝾螈到斑马鱼、 鼠标、 灵长类动物，和人类。
Interphotoreceptor 维甲酸结合蛋白作为 11-独联体-醇锥视觉周期中的生理有关承运人。
锥状细胞功能的恒定光线，负责调解白天人类视觉。像杆、 锥使用光敏分子 11-独联体-视网膜检测光，和在持续光照需要 11-独联体-视网膜连续供应。视网膜视觉周期是想通过使用 11-独联体-醇 Müller 细胞生成提供 11-独联体-视网膜锥向特权的供应。在周期内，从 Müller 细胞以锥内部网段，到 11-独联体-视网膜中氧化型的运是 11-独联体-视黄醇。氧化执行此步骤只在锥，从而使循环锥具体。Interphotoreceptor 维甲酸结合蛋白 (IRBP) 是一步之遥绑定 11-独联体-视黄醇的视网膜下空间中的维甲酸绑定蛋白。Irbp(-/-) 小鼠锥是维甲酸缺明的条件下，很可能 11-独联体-视黄醇供应中断的 IRBP 缺席。我们测试了 IRBP 通过保留的光 11-独联体-醇异构状态有助于向锥交付 11-独联体-视黄醇的假说。与电生理，我们显示 Nrl(-/-) 小鼠的圆锥体型感受器使用类似于野生型锥的锥视觉周期。然后，我们使用中孤立 Nrl(-/-)Rpe65(-/-) 视网膜的氧化测定，显示 IRBP 锥内提供 11-独联体-醇氧化和提高效率的氧化反应。最后，我们显示 IRBP 保护异构 11-独联体-醇存在光线下的状态。在一起，这些研究结果表明 IRBP 11-独联体-视黄醇运送到锥在发挥着重要作用，并可以便利下光锥细胞功能。
视紫红质激酶表达的变化会改变关闭的 Dim 闪存响应和中杆感受器的光适应。
杆感受器是函数的精美敏感光探测器在昏暗的光线。其光响应及时灭活棒来可靠地检测和计数光子的能力至关重要。杆传导灭活的关键一步是磷酸化的杆视色素，视紫红质，催化依赖的 G-蛋白受体激酶 1 （GRK1）。没有 GRK1 的情况下大大延长感受器的光响应，并增强了其对变性的敏感性。这项研究审查了从鼠标杆表示各种级别的 GRK1 来评估其功能如何调制而视紫红质灭活的光响应。
哺乳动物锥视觉周期促进快速 M L 锥形色素再生与 Interphotoreceptor 的维甲酸结合蛋白无关。
快速再生后其调亡的视色素是全天锥感受器的功能的关键。虽然回收杆色素再生发色团的视网膜色素上皮 (RPE) 的视觉周期的反应很好的特点，使锥色素的快速再生的相应机制了解得很少。剩余的一个关键问题是最近发现的锥特定视网膜视觉周期与哺乳动物锥色素再生的经典视网膜色素上皮依赖视觉周期的相对贡献。此外，它不清楚在加速哺乳动物锥色素再生中的什么作用，如果任何丰富的 interphotoreceptor 维甲酸结合蛋白 (IRBP) 推定的发色团，交通便利。要解决这些问题，我们使用 transretinal 录音来评估在孤立的视网膜和从控制和 IRBP 基因缺陷小鼠 eyecups M L 锥形色素再生。引人注目的是，鼠标视网膜促进 M L 锥形暗适应倍快于视网膜色素上皮。但是，完成锥恢复需要两个视觉的周期。我们的结论视网膜视觉周期是初始的快速再生的鼠标 M L 锥形颜料在暗适应过程的关键，而速度较慢的视网膜色素上皮视觉周期是完成这一进程所需。虽然删除 IRBP 的减少幅度和减缓鼠标 M L 锥形光动力学，锥适应光线明亮地稳定和动力学的锥暗适应是不会受影响或保持不变 eyecup 中孤立视网膜。因此，IRBP 不会加速锥色素再生并不是关键的函数的鼠标 M/L-锥在明亮的灯光。
在鼠标锥 Phototransduction 鸟苷酰环化酶调制的作用。
棒和锥状细胞中的消极 phototransduction 反馈及时终止其光响应并扩充其功能广泛的光照强度至关重要。调节棒中的 phototransduction 钙反馈机制进行了广泛研究。然而，使锥，迅速终止其光的响应和适应在明亮的光线，白天愿景的关键属性的相应调制机制仍然不理解。在锥，钙反馈给鸟苷酰环化酶可能是 phototransduction 调制的关键一步。鸟苷酰环化酶活性，调制而成钙结合鸟苷酰环化酶激活蛋白 （GCAP1 和 GCAP2）。在这里，我们使用单个单元格和 transretinal 录音从鼠标，以确定如何调节 GCAPs dark-adapted 反应以及在哺乳动物锥光适应。GCAPs 删除增加了三倍的幅度，并大大延长在暗的鼠标锥的光响应。它还降低了鼠标锥的背景照明的经营范围，并严重损害其光适应。因此，GCAPs 施加强大调制对哺乳动物锥 phototransduction 级联，发挥重要作用，在黑暗中和光适应期间设置的锥状细胞的功能特性。奇怪的是，尽管他们更好的适应能力和钙动态范围更广，哺乳动物锥被调制的 GCAPs 比哺乳动物棒程度较低。我们得出的结论警觉调制的实力差距不能解释在暗属性或哺乳动物棒和球果的经营范围内的差异。
G-蛋白 Betagamma 复杂是有效信号放大视野中的关键。
细胞生物学如何微弱的外部信号的信号的一个根本的问题产生强劲的生理反应。一种通用机制依赖于通过胞内叶栅 heterotrimeric G 蛋白介导的信号放大。此高放大倍数系统允许视网膜杆感受器来检测单个光子的光。虽然人们现在清楚了解到在 phototransduction transducin 杆特定 G 蛋白的 α-亚单位的作用，在此过程中的辅助 βγ 复杂的生理功能仍是一个谜。在这里，我们显示消除转导蛋白味蕾 γ 亚基极大地减少了完好的鼠标杆中的信号放大。结果是惊人的下降杆视觉敏感度和夜间视力严重受损。我们的研究结果表明 transducin βγ 复杂控制杆 phototransduction 层叠的信号放大，对于杆视网膜感光细胞的能力，能够在低光照条件运作是至关重要的。
杆和锥视觉色素和 Phototransduction 通过药理、 生理、 遗传，办法。
光在杆和锥体感受器的视色素激活启动我们的视觉感知。其结果是，组成的一种蛋白质、 细菌视紫红质，和发色团、 11-独联体-视网膜的视觉颜料的信号属性发挥关键作用塑造的感受器的光响应。药理、 生理和遗传工具的组合一直是有力的方式推动我们的细菌视紫红质和发色团以及它们如何影响视觉色素的功能之间的相互作用的理解。视觉的颜料的信号属性调节杆和锥状细胞，生产其独特的生理属性的功能的许多方面。
信号杆磁盘膜缺乏转导蛋白味蕾 βγ 复杂中的视紫红质的国家。
目的。定性的 transducin Gtβγ 复杂调制信号的视紫红质光活化和其生命周期中杆盘膜和完好棒属性中可能发挥的作用。方法。视紫红质光解作用进行了研究使用紫外可见光谱及在场羟胺的情况下快速扫描光谱中高度纯化的野生型和 Gtγ 缺鼠标杆盘膜。视紫红质光活化和 transducin 之间的复杂地层是额外的 metarhodopsin (元) 二、 测定用来衡量的。恢复黑暗的当前和闪存敏感性的个别完好无损的野生型和 Gtγ 缺鼠标杆是用单个单元格吸录音来衡量的。结果。Photoconversion 的视紫红质元到我 / 元二平衡收益通常后消除 Gtβγ 复杂。元我 / 元二、 比率、 元二衰变，率反应性的 meta 朝元三形成的 Gtγ 缺杆盘膜率与羟胺，二是与野生型样品中观察到的那些相同。低强度光照下额外元二中 Gtγ 缺光盘的数量大大减少。12%视紫红质漂白后暗当前复苏的初始速率是 Gtγ 缺棒中快了三倍，而后期当前恢复率大致维持不变。突变体棒还展出更快 postbleach 恢复对 flash 的敏感性。结论。调亡和热衰减的视紫红质进行同样在野生型和 Gtγ 缺鼠标杆，但视紫红质光活化和 transducin 之间的复杂地层严重损害 Gtβγ 如果没有。由此产生的低转导激活有助于恢复紫外光响应速度更快后中度色素漂白 Gtγ 缺棒中。
