Translate this page to:
German
In JoVE (1)
Other Publications (18)
- BioTechniques
- Journal of Neurosurgery
- Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.)
- Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.)
- Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.)
- Molecular Medicine (Cambridge, Mass.)
- Molecular Medicine (Cambridge, Mass.)
- The American Journal of Pathology
- Toxicological Sciences : an Official Journal of the Society of Toxicology
- Nano Letters
- Nano Letters
- BioTechniques
- Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.)
- Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.)
- Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.)
- Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.)
- Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.)
- Molecules (Basel, Switzerland)
Automatic Translation
This translation into German was automatically generated.
English Version | Other Languages
Articles by Vladimir V. Didenko in JoVE
JoVE Bioengineering
In-vitro-Assembly von Semi-künstliche molekulare Maschine und ihre Verwendung zum Nachweis von DNA-Schäden
1Neurosurgery, Baylor College of Medicine, 2Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 3Molecular & Cellular Biology, Baylor College of Medicine
Wir zeigen die Montage und Anwendung eines molekularen Maßstab Gerät durch eine Topoisomerase Protein versorgt. Das Konstrukt ist ein bio-molekularen Sensor, der im Wesentlichen zwei Arten von DNA-Brüchen in Gewebeschnitten Etiketten durch Anbringen von zwei unterschiedlichen Fluorophoren an ihren Enden.
Other articles by Vladimir V. Didenko on PubMed
Die Apoptose Von T-Lymphozyten Eindringen Glioblastome Multiforme: Ein Möglicher Tumor Abwehrmechanismus
In-situ-DNA-Ligation Als Ein Verfahren Zur Markierung Von Apoptotischen Zellen in Gewebeschnitten. Ein Überblick
Nachweis Von Spezifischen Doppelsträngigen DNA-Brüche Und Apoptose in Situ Unter Verwendung Von T4 DNA-Ligase
Visualisierung Von Irreparablen Ischämische Schädigung Des Gehirns Durch Selektive Markierung Von Doppelstrang-DNA Mit Stumpfen Enden Bricht
Frühe Nekrotische DNA-Abbau: Gegenwart Von Stumpfendigen DNA-Brüche, 3 'und 5'-Überhänge an Der Apoptose, Aber Nur 5-Überhänge Anfang Nekrose
Thiomersal Induziert DNA-Brüchen, Caspase-3-Aktivierung, Membran-Schäden Und Zelltod in Kultivierten Menschlichen Neuronen Und Fibroblasten
Semi-Artificial Fluoreszierenden Molekulare Maschine Für DNA-Schäden-Erkennung
Die Gestaltung des künstlichen molekulare Maschinen ist kompliziert, weil die Mechanik verwendet in Macromachines nicht leicht anpassbar für Nano-Umgebungen ist. Konstruierten wir ein semi-artificial Molekulare Gerät, enthält einen natürlich vorkommendes molekulare Maschine-a des Vaccinia Virus kodiert Protein-verbunden mit einem künstlichen Teil. Das zusammengebauten Konstrukt macht zwei Leuchtstoff beschriftetem Detektor-Einheiten. Es ist der erste Sensor gezielt Aufspüren von verschiedene Arten von DNA-Brüchen, Beispiel für einen praktischen Ansatz für die Gestaltung von molekularen Geräte.
Visualisierung Der Einzelnen Einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhren Durch Fluoreszierende Polymer Verpackung
Meerrettich Peroxydase Ausgerichtete Nanotubes Mit Quantenpunkte Fluoreszierende Bezeichnen
Wir beschreiben die erste Enzym-gesteuerte Technik für fluoreszierende Kennzeichnung von Single-walled Carbonnanotubes (SWNTs). Die Kennzeichnung erfolgte über enzymatische Biotinylierung Nanotubes in der Tyramide-Meerrettich-Peroxidase (HRP)-Reaktion. Sowohl direkte als auch indirekte Fuorescent Kennzeichnung von SWNTs wurde erreicht mit Biotinyl-Tyramide oder Leuchtstoff markierte Tyramides. Biotinylierten SWNTs reagierte später mit Streptavidin-konjugierten Fluorophore. Verknüpfung von Halbleiter-Nanokristallen, führte Quantenpunkte (Q-Punkte), an die Oberfläche von Nanoröhren ihre Fluoreszenz-Visualisierung, wohingegen konventionellen Fluorophore direkt an SWNTs gebunden oder durch Biotin-Streptavidin-Bindung, waren völlig ausgelöscht. Enzymatische Biotinylierung erlaubt fluoreszierende Visualisierung von Kohlenstoff-Nanoröhren, die für eine Reihe von biomedizinischen Anwendungen nützlich sein könnte. Darüber hinaus können andere organische Moleküle wie Proteine, Antikörper oder DNA, biotinylierten SWNTs mit diesem Ansatz konjugiert werden.
Oszillierende Sonde Für Dual Nachweis Von 5'PO4 Und 5' Bricht OH DNA in Gewebekapiteln
Verschiedene Arten von DNA-Schnitte dienen als Marker der Apoptose für die Erkennung von apoptotischen Zellen in-situ. Wir hat vor kurzem eine Ligase-basierte in-situ-Assay, die spezifisch für eine einzelne Art von DNA-Schäden--eine Doppel-Strang-Pause DNase I-Typs, wobei 5'PO4. Hier beschreiben wir einen des Vaccinia Topoisomerase I-basierte Ansatz um eine andere Art von DNA-Schäden in-situ--Doppel-Strang Pause DNase-Typ II, mit 5'OH zu kennzeichnen. Der Assay verwendet eine neue Art der Sonde, einem molekularen Oszillator. Die Sonde self-assembles in Lösung aus einer Dual-Haarnadel-Oligonukleotid und Vaccinia-Topoisomerase I. Das Enzym kontinuierlich trennt und religates zwei Leuchtstoff beschriftete Haarnadeln, die Energieübertragung teilnehmen können. Wir beschreiben die gelungene Verbindung von Topoisomerase- und Ligase-basierten Systemen in ein in-situ-Assay. Die Probe wird eine oszillierende Sonde für den gleichzeitigen Nachweis von zwei Arten von DNA-Schnitte in Gewebekapiteln verwendet.
In-situ Kennzeichnung Von DNA-Brüche Und Apoptose Durch T7-DNA-Polymerase
Die native T7-DNA-Polymerase ist eine schnelle und hoch prozessualen Enzym, das in-situ Nachweis von Apoptosis und verschiedene Arten von DNA-Brüchen verwendet werden kann. Die Technik ist schnell und einfach und es ist nachgewiesen, Beschriften von frühere Stadien von Apoptosis im Vergleich zu der Terminaltransferase-Technik. Die in-situ Kennzeichnung Anwendungen der T7-DNA-Polymerase sind dargestellt und zusammengefasst aus der DNA Schaden Erkennung Sicht. Zusammen mit der Diskussion über ihre Vorteile und Grenzen der ausführliche Protokolle zur Verfügung.
In-situ-Verbindung: Ein Jahrzehnt Und Die Hälfte Der Erfahrung
Die in-situ Ligaturen (ISL) Methodik erkennt Apoptotic Zellen durch das Vorhandensein von charakteristischen DNA-Doppel-Strang-Pausen. Eine beschriftete Doppelstrang-Sonde ist eine Ligatur zu den Doppel-Strang Pausen in-situ auf Gewebekapiteln. Wie der beliebte TUNEL-Test erkennt ISL Zellen in Apoptose basiert auf der anhaltenden Zerstörung der DNA von Apoptotic Nukleasen. Es ist im Vergleich zu TUNEL, spezifischere für Apoptosis im Vergleich zu anderen Ursachen von DNA-Schäden, Reparaturfähige Schäden und Nekrose. In den fünfzehn seit ihrer Einführung wurde ISL in mehreren hundert Publikationen verwendet. Hier schauen wir uns die Entwicklung der Methode, seinen aktuellen Status und ihre Verwendungen und Einschränkungen.
In-situ Verbindung Vereinfacht: Mit PCR-Fragmente Für Abfragung Von Doppel-Strang-DNA Im Gewebe Abschnitte Unterbrochen Wird
Die vereinfachte in-situ Ligaturen ist beschrieben. Alle Reagenzien für den Assay können einfach ermittelt werden, in einem molekularen oder Zelle Biologie-Labor. Die Technik verwendet Verbindung der doppelsträngige, PCR gewonnenen DNA-Fragmente mit Digoxigenin oder Fluorophore hochselektive Nachweis von apoptotischen Zellen in Paraffin-eingebetteten Gewebekapiteln beschriftet. Zwei Arten von DNA-Fragmenten, vorbereitet durch PCR sind beschäftigt. Das Fragment von Taq-Polymerase synthetisiert enthält Einzel-Base 3' Überhänge, während das Pfu-Polymerase-gemacht-Fragment stumpf ist beendet. Beide Fragmente können verwendet werden, so spezifisch, vertrauliche und kostengünstige DNA-Schäden-Sonden. Nach der Verbindung zum Apoptotic Kerne in Gewebekapiteln zeigen sie, dass das Vorhandensein von Doppel-Strang-DNA mit Einzel-Base 3' Überhänge sowie stumpfen Enden bricht.
5'OH DNA in Apoptosis Und Ihre Kennzeichnung Von Topoisomerase-Ansatz Bricht
Kürzlich wurde das Konzept der apoptotischen Zelle Beseitigung erweitert und programmierten Zelltod wird nicht mehr als einzelne zelluläre Ereignis angesehen. Die vollständige Beschreibung des Apoptotic Prozesses jetzt umfasst zwei Phasen: die sekundärseitige Zelle-Demontage und fremdgesteuert Beseitigung der apoptotischen Zelle Leichen von Erregerelimination Zellen. Die zweite phagozytische Phase ist wichtig, stark konserviert, und ist sogar noch wichtiger als die interne Phase der Zelle Demontage. Dies ist, weil dadurch den vollständigen Abbau der Sterbenden Zelle DNA, verhindern die Freisetzung von pathologischen, virale Tumor-DNA und Self-immunization sichergestellt wird. In verschiedenen Zellen und Arten von Säugetieren zu fliegen ist ein einzelnes konservierte Enzym--DNase II verantwortlich für die Beseitigung der zellulären DNA in der zweiten "Westen bis" Phase der Apoptose. Hier präsentieren wir ein Assay für die selektive phagozytische Phase der Apoptose. Die Technik nutzt die Tatsache, dass die phagozytische DNase II identifizierbare Unterschrift DNA Brüche, produziert, die von "Vaccinia" Topoisomerase beschriftet werden können. Der Assay erlaubt Kennzeichnung der zuvor unterschätzt Phase der Apoptotic Ausführung und ist ein nützliches Werkzeug im Arsenal Apoptose-Erkennung.
Fluoreszierende Sonden Erkennen Die Phagozytische Phase Der Apoptose: Enzym-Substrat-komplexen Topoisomerase Und DNA
Die anfängliche selbstregelnden Selbstmord-Phase generiert in Apoptosis zelluläre Leichen, die in der nachfolgenden Phase der Abfallwirtschaft in der Phagolysosomes von Profi- und Amateursport Fresszellen verdaut werden. Dies gewährleistet die vollständige Beseitigung des genetischen Materials der oft pathologische, virale oder Krebs-DNA-Sequenzen enthält. Obwohl die phagozytische Phase entscheidend für die effiziente Ausführung von Apoptosis ist, gibt es derzeit einige Methoden, die speziell für die detaillierte Visualisierung im festen Gewebe Abschnitt Format. Um dieses Problem zu beheben haben wir neue fluoreszierende Sonden für in-situ Forschung entwickelt. Die Sonden selektiv visualisieren aktive phagozytische Zellen Verwandtschaftsgruppe (professionelle, Amateur Fresszellen oder umliegenden Gewebezellen) die verschlingen und verdauen Apoptotic Zelle DNA. Die fluoreszierenden Sonden sind die kovalent gebundene Enzym-DNA-Zwischenprodukte in eine Topoisomerase-Reaktion mit bestimmten "Start" Oligonukleotide hergestellt. Sie erkennen eine spezifische Markierung der DNase II Schneidefunktion, die ausschließlich in Phagolysosomes der Zellen vorkommt, die Apoptotic Kerne einhüllte. Die Sonden bieten Momentaufnahme-Bilder von der Verdauung-Prozeß im zellularen Organellen für die tatsächliche Ausführung phagozytische Verschlechterung der apoptotischen Zelle Leichen verantwortlich. Wir angewandt die Sonden zur Visualisierung der phagozytische Reaktion im Gewebe Abschnitte des normalen Thymus und in mehreren menschlichen Lymphome. Wir diskutieren auch die Natur, die Stabilität und die Eigenschaften der DNase-Typ-II-Pausen als eine Markierung der phagozytische Aktivität. Diese Entwicklung stellt ein nützliches fluoreszierende für Studien von Pathologien wo Abfertigung der sterbende Zellen entscheidend, wie Krebs, Entzündung, Infektion und Auto-immun-Erkrankungen ist.
