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Articles by Ying LItingtung in JoVE
JoVE Neuroscience
髄芽腫の幹細胞の単離、濃縮、およびメンテナンス
Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University
このプロトコルは、分離、濃縮、および異所性ソニックヘッジホッグ経路の活性をもつ変異マウス由来の髄芽腫の腫瘍幹細胞の維持を説明します。
JoVE Neuroscience
免疫不全マウスにおける髄芽腫細胞の頭蓋内同所Allografting
1Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, 2Department of Neurology, Vanderbilt University
このプロトコルは、二次髄芽腫を開始するために、マウスの髄芽腫の組織の分離と解離を説明し、免疫不全レシピエントマウスに腫瘍細胞のallograftingそれに続く。
Other articles by Ying LItingtung on PubMed
SHHとGli3は四肢骨格形成のために不要ですが、桁の番号とIDを調節する
現在のほとんどのモデルは、羊膜類手足の前後開発の主要な決定要因として、ソニックヘッジホッグ（Shh）を提案する。 Shhのタンパク質は骨格要素の形成を指示すると、標的遺伝子の発現を用量依存的な活性化を介して桁のIDを指定する必要が言われています。しかし、SHHの標的遺伝子の同定、その発現を制御する調節メカニズムは、よくわかっていないままです。 Gli3（ヒトグレイグのcephalopolysyndactyly症候群に関与する遺伝子）が負の後部中胚葉にその発現と影響力を制限することにより、Shhを調節することが提案されている。ここでは、ShhのとGli3は四肢骨格要素の形成のために不要であることを示すマウスの遺伝的解析を報告しシーッ（ - / - ）Gli3（ - / - ）四肢遠位完全かつ多指のですが、完全に野生型の桁のIDを欠いている。我々は、骨格パターニングと尾根·メンテナンスのShhのシグナル伝達の効果は必ずしもGli3を介して媒介されていることを示している。私たちは、四肢骨格パターン形成におけるShhとGli3の機能がGli3転写活性化因子と抑制活動の相対的なバランスを調節することにより、手足の多指の可能性に五指状の制約を課すと、数字のIDの仕様を整理し、autopodial形態の精製に限定されていることを提案する。
ソニック·ザ·ヘッジホッグシグナル伝達は、マウスの肺器官形成期Gli3処理、間葉系幹細胞増殖、および分化を調節する
GLIのタンパク質によって媒介されるソニックヘッジホッグ（Shh）シグナル伝達の欠如が、重度の肺低形成につながる。しかし、肺の開発におけるGLI遺伝子の正確な役割は十分に確立されていません。我々は、ソニックヘッジホッグシグナル伝達を示す開発マウス肺でそのリプレッサーフォーム（Gli3R）を生成するGli3のタンパク質分解を防ぐことができます。 、間充織シーッで（ - / - ）またはシクロパミン処理野生型（WT）、肺、我々はGli3Rレベルが上昇しました、このレギュレーションは、ソニックヘッジホッグで観察された増殖と分化の欠陥に貢献して表示されます（ - / - ）ここで、Gli3は正常に発現されています。契約では、Shhのを見つけました（ - / - ）Gli3（ - / - ）肺が強化された成長の可能性を示す。血管も拡張されます。対照的に、気管支筋形成にはShhので不在のまま（ - / - ）Gli3（ - / - ）Shhのと比べて（ - / - ）肺。シーッでアップレギュレート遺伝子（ - / - ）Gli3（ - / - ）Shhの相対（ - / - ）肺はWnt2と、その発現がShhの依存であることが報告されている驚くべきことに、Foxf1が含まれています。サイクリンD1、D2、およびD3抗体の標識化はまた、正常型と変異型肺で異なる発現パターンを明らかにした。 （ - / - ）とShhの部分抑制解除（ - / - ）我々は、両方のソニックヘッジホッグの細胞老化の抑制にリンク、Tbx2とTbx3の大幅な抑制を見つけた。Gli3（ - / - ）、肺、Tbx4とTBX5式は以下である間、変異体では影響を受けます。我々の調査結果は、いくつかの重要な遺伝子を調節することにより、肺の成長と分化におけるGli3処理のShhのシグナル伝達の役割に光を当てる。
コレステロールの変更は、肢芽におけるShhグラデーションの拡散を制限
極性化活性帯で生産ソニックヘッジホッグ（Shh）は、羊膜類四肢の前後開発の主要な決定要因である。成熟しており、アクティブなShh発現タンパク質は、そのC末端にコレステロール変更され、変更の疎水性の性質は、そのソースからShhのリリースの7回膜貫通型蛋白質、（mDispA）に送出する機能を必要とします。現在のモデルは、コレステロール部分は肢芽におけるShhのグラデーションの広がりを促進することを示唆している。しかし、このモデルでは、Shhの多量のコレステロール部分の役割についてのショウジョウバエのではなく、現在の思考に沿った調査結果と矛盾しています。したがって、コレステロール部分は応答性組織でその活性勾配の形状に関連するShhのpostrelease外の動作にどのような影響を及ぼすかは依然として不明である。ここでは、Shhのは、コレステロールの変更を欠いていることを示すマウスでの機能解析を報告し（ShhN）ターゲット遺伝子の発現と前肢の中胚葉Gli3処理の変調レベルと一貫性のある異所性のShhの経路の活性化を誘発する、長距離を広めるために増加する傾向を持っています。これらの分子変化はShhN変異の桁mispatterningに反映されます。さらに、我々は、肢芽の前後軸を越えShhNの長距離移動のための直接的な証拠を提供しています。我々の調査結果は、コレステロール部分は制限はなく、初期の開発時には肢芽全体にShhのpostrelease普及を促進することにより、Shhのモルフォゲン勾配の範囲や形を調節することをお勧めします。
異常なBMPシグナルと脊索は食道閉鎖症の病因における層間はく離
気管食道瘻食道閉鎖症（EA / TEF）として知られている人間の前腸奇形が原因不明の4000出生に1で発生します。タイプC EA / TEF、人間の最も一般的なフォーム、およびアドリアマイシン誘発性ラットEA / TEFモデルに著しく類似した脊索欠陥が表示された私たちは、Nogginを欠損したマウスは（ - / - ）（NOG）ことがわかった。 （ - / - ）削減接着と破壊され、基底膜に関連付けられていた背前腸内胚葉、減少を示した胚性食道閉鎖症、ノーグにあった。しかし、ノーグの重要なアポトーシス（ - / - ）背側前腸は認められなかった。そのノギン関数は、その適切な背側前腸から剥離のために脊索板に要求さを示唆し、脊索を（ - / - ）の代わりに、非脊索、内胚葉性、細胞は木栓で発見された。特に、木くぎでBMP7機能をアブレーション（ - / - ）胚は、EA / TEF病因にノギン媒介BMP7対立の重要な役割を確立し、EA / TEFと脊索分岐欠陥を救助した。
異所性ソニック·ザ·ヘッジホッグシグナリングは終脳背側正中線の開発を阻害する：人間の全前脳症のための含意
全前脳症（HPE）は、ヒトの脳の最も一般的な発達異常であり、その重症型では、大脳半球は完全に2つの別個の半分に分離に失敗します。腹側前脳誘導の混乱が最もHPEケースを根底に考えられているが、HPE患者のサブセットは、原因不明の脳背側正中線構造の優先的な発育不全を示す。本研究では、ソニックヘッジホッグ（Shh）は一つの対立遺伝子（ShhN / +）マウスでは皮質領域で腹前駆細胞マーカーの発現を誘導し、終脳背側正中線の開発を損なうために早期終脳に異所性のShhのシグナル伝達を引き出すことができるのコレステロール部分を欠いていることを示している。長引く異ShhNシグナリング障害BMPとFGF8の発現上昇を介して背パターニングの中心部からはWntシグナル伝達、拡張、細胞増殖につながる、細胞死や障害屋根板の形態形成を減少させた。したがって、ShhN / +皮質の裾、海馬と脈絡叢を含む変異体終脳背側正中線構造は、いずれかの形式に失敗したか、または低形成であった。驚くべきことに、ShhN / +変異体はこのように分割する前大脳半球の障害などの表現型の特徴のスペクトルを表示された、穏やかなHPEとヒト患者で観察されている水頭症および口蓋裂は、SHHいずれかで切り捨ての変異に起因するSHHNタンパク質を産生すると予測対立遺伝子。我々は、異所性の上昇Shhのシグナルは背側終脳正中線の形態を損なう、と背側正中線欠陥と人間のHPEを模倣した正中構造の非切断につながる可能性が提案している。
パターニングにおけるソニック·ザ·ヘッジホッグのコレステロール修飾終脳および脊髄の領域に固有の要件
ソニックヘッジホッグ（Shh）は、神経管の背腹軸パターニングにおけるモルフォゲンとして脊索と脊索前板機能の軸方向のシグナルセンターから分泌される。アクティブなShhを一意にコレステロール修飾とコレステロールの疎水性の性質は、それが神経管に広がるShhを調節する可能性が示唆されています。ここでは、終脳と脊髄のパターンの異なる種類の細胞へのコレステロール部分（ShhN）を欠いているShhの容量を検討した。 ShhNを発現するマウスでは、我々はShhNは急速にその合成部位から広がる可能性があるという概念と一致し、脊索前板と脊索で低レベルShhNを検出しました。ソニックヘッジホッグ（N / - ）の腹側ニューロンの仕様および神経節隆起の開発に対し、驚くべきことに、我々は、低レベルのShhNは、脊髄の腹側の細胞型の完全なスペクトルの生成を引き出すことが判明し終脳が著しく損なわれたが、示唆されている終脳パターニングは、ローカルのShhの濃度と拡散の変化に敏感である。契約では、我々は長期ShhNの活性を示す背側終脳における異所性部位で腹マーカーのShhの経路の活性と発現の誘導を観察した。今回の知見は、Shhの希釈を制限することでコレステロール部分のために重要な役割とパターニング終脳のための規制緩和の広がりを示しています。我々は、パターニングにShhNその差動効果を提案する脊髄対終脳腹側神経上皮と規制緩和Shhの拡散挙動に背側組織の反応性の違いにおけるShh発現の維持の地域差に起因する可能性があります。
分化1の阻害剤は、マウスの肺損傷のブレオマイシンモデルで血管内皮の生存を促進する
遺伝子のIdファミリーは、塩基性ヘリックス - ループ - ヘリックス転写因子の負の調節因子をコードし、そのような増殖、アポトーシス、分化、および移行などの多様な細胞プロセスに関与している。しかし、肺傷害におけるId1の特定の役割が検討されていない。ブレオマイシンは広く急性肺障害と線維化の動物モデルを生成するために使用されています。本研究では、二重免疫標識および定量的なフローサイトメトリー解析により明らかにされたID1の発現が著しく、肺では、主に内皮細胞においてアップレギュレートされた、ブレオマイシンの挑戦で、あることがわかった。 ID1の機能喪失（ - / - ID1（））を持つマウスは、ブレオマイシン誘発損傷後増加した血管透過性および肺の血管内皮アポトーシスを表示します。培養されたID1（ - / - ）ブレオマイシンにさらされた場合肺微小血管内皮細胞はまた、減少率を示した。ダウンレギュレーションのBcl-2は、肺の血管内皮アポトーシスを促進する可能性があることを示唆し、内皮細胞（ - / - ）私たちは、ID1の主要な抗アポトーシスタンパク質、Bcl-2のレベルの低下を検出しました。したがって、我々は、id1は障害に対する成人の肺の内皮細胞の生存を促進する上で重要な役割を果たしていることを提案する。さらに、ブレオマイシンにさらされたID1（ - / - ）マウスは、肺のアップレギュレーションは、肺の恒常性に重要な役割を果たしていることを示唆しID1、増加した肺のコラーゲンの蓄積と線維化を示した。
BMP4は、気管形成に必要とされています。気管無形成のための新しいマウスモデル
気管無形成/閉鎖（TA）は、呼吸管が成長に失敗しているまれではあるが致命的な先天性疾患である。この深刻な病気の病因はほとんどわかっていない。我々は、BMPシグナリングが気管原基が密接にフロイドタイプII病理、最も一般的なフォームに似て喪失気管表現型の結果を発信し、BMP4の標的アブレーション（BMP4（CKO））前方に前腸に目立つ存在であることがわかったヒトにおけるTAの。 BMP4（CKO）の胚では、気管の仕様には影響しませんでしたが、その伸長が著しく低下して上皮細胞と間葉系幹細胞増殖に起因する障害されていた。契約では、我々はまた、サイクリンD1の発現の有意な減少、細胞増殖に関連付けられたキーの細胞周期レギュレータを観察した。しかし、BMPシグナルの増殖効果は、Wntシグナルに依存しないように表示されます。興味深いことに、我々は、BMPシグナル伝達が細胞増殖に関連付けられているERKのリン酸化を促進することを示唆し、BMP4（CKO）腹側前腸で活性化された細胞外シグナル制御キナーゼ（ERK）の有意な発現低下を発見しました。本研究では、前腹側前腸の増殖応答を調節することにより、気管の形成にはBMPシグナリングを結ぶ最初の証拠を提供しています。私たちのBMPシグナル伝達は、非正規のErk活性化と細胞増殖が関与して新たなマウスモデルを提供することにより、ヒト気管奇形に小屋の光を見つける。
Gli3欠損マウスの異常舌の開発に伴う口蓋裂を出展
Palatogenesisは、適切な成長、高度、および口蓋分裂文形成につながることができ、これらのプロセスにおける口蓋突起と収差の融合に依存します。我々は、ソニックヘッジホッグシグナルの非存在下でのリプレッサーとしての役割で知られてGli3、欠損マウスで分裂文形成口蓋の発生率が高いを観察した。 - マウス口蓋裂のいくつかの現在のマウスのモデルとは対照的に、メッケル軟骨の拡張子、頭蓋神経堤の移行、口蓋棚の増殖、アポトーシス、とShh、BMP、FGF、及びTgfbetaによって媒介される主要なシグナル伝達コンポーネントは、Gli3-/の影響を受け登場しました。 Gli3-/の口蓋分裂文形成 - マウスは、一貫してGli3とタイムリーな口蓋棚の上昇と結合するための通常の舌の形態形成の重要な役割を果たしが関与し、そのような平坦化に失敗すると不適切なポジショニングとして舌の異常と関連していた。さらに、Gli3-/ - 変異 - 舌せずにローラー培養で増殖させた口蓋は、異常な舌はおそらくGli3-/に参加口蓋棚のための障害であることを示唆して融合させることができます。
SHHとGli3活動は、運動ニューロン前駆細胞のタイムリーな生成に必要な
開発脊髄内の個別の腹側ニューロンのサブタイプの世代は、転写因子のGLIの家族によってShhのシグナル伝達媒介を必要とします。 Shhの遺伝学的研究（ - / - ）Gli3（ - / - ）二重変異体はShhのでGli3リプレッサー活性の阻害は、運動ニューロンを含む様々なニューロンの生成のために十分であることが示された。 （ - / - ）本研究では、ただし腹側神経前駆細胞がShhのに通常の数字で開始されることを示す。Gli3（ - / - ）変異体は、運動ニューロン前駆細胞のその後の姿はとの併用、約20時間の遅れを示しています。汎神経分化プログラムと腹側神経前駆細胞の細胞周期の出口の活性化の遅延。したがって、SHHは（ - / - ）Gli3（ - / - ）変異体脊髄運動ニューロンの分化や腹側神経前駆細胞プールの蓄積の遅延を示す。 （ - / - ）変異体は、構成的Shhの経路の活性は、モータニューロンの異所性、早期分化を誘発するのに十分であるShhのとGli3活動運動ニューロン前駆細胞のタイムリーな外観を促進するための要件は、さらにPTCH1の分析によってサポートされています腹側神経前駆細胞の費用。一緒に、我々の分析はGli3-脱抑制機構を介して、その十分に確立され背腹パターニング機能を超えて、SHHシグナル伝達がさらに発展脊髄の運動ニューロン前駆細胞のタイムリーな外観を促進するために必要とされる、ことを示唆している。
ソニック·ザ·ヘッジホッグシグナリングは後脳脈絡叢の新規上皮前駆ドメインを調節する
脈絡叢（CHPS）は、血液·脳脊髄液（CSF）の障壁として、脳の恒常性の調節、機能に関与する血管、分泌器官である。彼らの重要な役割にもかかわらず、CHP開発を推進調節機構の限られた理解があります。ソニックヘッジホッグ（Shh）、胚発生やがんの重要な分泌シグナルが強く差別化後脳のCHP上皮（hChPe）で表されます。しかし、我々は、Shhのを表現していないhChP内の個別の上皮ドメインを識別しますが、Shhのシグナルを表示します。我々はhChPeに直接貢献すること前駆ドメインとして機能し、下唇の菱形（LRL）、胚ゾーンに隣接するこの独特なShhのターゲットフィールドがわかります。条件Shhの変異体解析により、我々はShhのシグナル伝達がE12.5ごろから、後期胚発生を通じてhChPe前駆細胞の増殖とhChPe拡張を調節していることを示しています。以前の研究では、LRLによってhChPeへの直接の寄与はE14の周りに停止することを示している一方、我々の調査結果は、開発全体の継続的な成長と後脳脈絡叢の拡大を推進する上でShhの生産およびシグナリングのための新規な組織の自律的な役割を明らかにした。
ソニック·ザ·ヘッジホッグのTransventricular配信が小脳脳室帯の開発に不可欠である
脳室帯（VZ）と菱形リップ：小脳ニューロンは2胚neuroepitheliaから生成されます。 VZ常駐前駆細胞の増殖能を維持するシグナル伝達機構は、とらえどころのないままになります。我々は、ソニックヘッジホッグ（Shh）シグナル伝達が小脳VZでアクティブと放射状グリア細胞の増殖とGABA作動性介在の拡大に不可欠であることを明らかにした。私たちは、小脳はその初期のVZに信号Shhの源ではないことを示している、とShhのリガンド配信のためにtransventricularパスを示唆している。契約では、循環胚脳脊髄液におけるShhタンパク質の存在を検出しました。本研究では、規制緩和Shhのシグナルに関連付けられている小脳の疾患の病因におけるVZ前駆細胞の潜在的な貢献を強調し、小脳の脳胚ゾーンに不可欠な細胞増殖シグナルとしてShhを識別し、神経発生の調節にShhのtransventricular源を明らかにする。
