Summary
Overview
Ein Western Blot wird benutzt, um spezifische Proteine in einer elektrophoretisch aufgetrennten Probe nachzuweisen. Nach der Auftrennung mit Hilfe eines Verfahrens das “Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese”, oder SDS-PAGE, genannt wird, benutzt man einen Westerntransfer um Proteine aus dem Polyacrylamidgel auf eine Membran zu übertragen, welche die Proteine in ihrer Position festhält. Danach wird die Membran mit Antikörpern inkubiert – ein Prozess der auch Immunblotting genannt wird. Beim Immunblotting finden Antikörper-Protein und Antikörper-Antikörper Bindungen durch spezifische Bindungsseiten statt, wodurch die hohe Spezifizität die gebraucht wird um ein einzelnes Protein nachzuweisen, sichergestellt wird. Die Detektion von Antikörpern findet mit Hilfe von Reportersystemen statt, welche die Benutzung von Enzymen einschließen. Diese Enzyme sind an einem Ende des Antikörpers angebracht und reagieren mit Substraten um Farb- oder Lichtänderungen zu bewirken. Diese Signale können dann abgebildet und mit Densitometrie quantifiziert werden.
Dieser Videoartikel präsentiert einen Überblick über die Western Blot Methode und beschreibt einen Westerntransfer, die Benutzung von Antikörpererkennung und Bildanalyse. Die Schritte im Westerntransfer, wie zum Beispiel der Aufbau des “Sandwiches” und die Transferbedingungen, sowie die Theorie hinter der Antikörperbindung und wie man diese Antiköper erkennt, werden im Detail erörtert. Die weitreichenden Anwendungen dieses Verfahrens werden mit Hilfe von mehreren Beispielen, wie dem Nachweis von Protein-Protein Interaktionen und der Identifikation von individuellen Proteinen in Komplexen, gezeigt.
Procedure
Der Western Blot ist ein wichtiges Verfahren, bei dem Forscher mit Hilfe von Antikörpern untersuchen können, ob spezifische Proteine in einer elektrophoretisch aufgetrennten Probe enthalten sind.
Es gibt drei Schritte in dieser Technik, die für qualitativ hochwertige Resultate wichtig sind: das Elektroblotting, das Immunblotting und die Detektion. Vor diesen Schritten wird die Probe mit SDS-PAGE aufgetrennt. SDS-PAGE ist ein Verfahren in dem denaturierte Proteine in einem Polyacrylamidgel nach ihrer Größe separiert werden.
Elektroblotting nennt man auch Elektrotransfer. Man braucht eine Transferkassette, die das “Sandwich“ zusammenhält, und eine Transferkammer um das Protein von dem Acrylamidgel auf eine dünne Membran zu übertragen. Das sogenannte “Elektrotransfersandwich“ besteht aus dem Gel und einer speziellen Membran, die zwischen zwei Blätter Filterpapier gelegt werden. Während des Transfers wird ein elektrisches Feld genutzt um Proteine durch das Gel auf die Membran zu transferieren, wo sie durch hydrophobische Interaktionen fest gehalten werden.
Beim Immunblotting verwendet man Antikörper, welche die Membran auf spezifische Proteine hin untersuchen. Antikörper sind große Y-förmige Proteine, die zwei Fragmente (auch Fab Fragmente genannt) enthalten, die andere Proteine binden. Die Fab Fragmente definieren das spezifische Epitop, oder den spezifischen Teil des Proteins, das an einen Antikörper bindet.
Monoklonale Antikörper sind Antikörper, die nur ein einziges Epitop erkennen. Sie werden wegen ihrer Spezifizität verzugsweise für das Immunblotting benutzt. Im Gegensatz dazu sind polyklonale Antikörper verschiedene Antikörper, die auf verschiedene Epitope des gleichen Antigens – also dem Protein für welches der Antikörper spezifisch ist – reagieren. Monoklonale Antikörper, die ein lineares Epitop erkennen, werden bevorzugt verwendet, da sie denaturierte und linearisierte Proteine erkennen können. Das ist wichtig, denn viele Antikörper erkennen nur strukturierte Epitope, das heißt sie erkennen nur Proteine in ihrer nativen 3D Struktur.
Neben den Fab Fragmenten bestehen Antikörper auch aus Fc Regionen, die spezifisch für das Tier sind, in welchem der Antikörper produziert wurde. Beim Immunblotting wird diese Region hauptsächlich als Epitop für den sekundären Antikörper benutzt – also einem Antikörper der den ersten Antikörper erkennt, welcher wiederum das Protein bindet, das wir nachweisen wollen.
Um ein sichtbares Signal zu produzieren, sind Antikörper durch ihre Fc Region oft mit einem Reporterenzym, wie zum Beispiel der alkalinen Phosphatase oder der Meerrettichperoxidase, verbunden. Diese Reporterenzyme produzieren nachweisbare Signale, in dem sie mit einem Substrat reagieren das Farbänderungen bewirkt oder Licht produziert.
Diese Änderungen können mit Hilfe von Densitometrie quantifiziert werden. Densitometrie ist ein Verfahren das benutzt wird um die Dichte einer Proteinbande mit Hilfe von Bildanalysesoftware zu berechnen. Die Banden können dann direkt mit einem Referenzstandard oder durch interne Kontrollproben quantifiziert werden.
Für einen erfolgreichen Elektrotransfer wird das Gel zuerst für 15 Minuten in Transferpuffer equilibriert. Die Membran wird auch abhängig von den Herstellerangaben equilibriert.
Danach wird das sogenannte „Gelsandwich“ im Transferpuffer vorbereitet um Luftblasen im Transfersystem zu vermeiden. Luftblasen in dem Transfersandwich können durch Rollen mit einer kleinen Pipette entfernt werden. Schon kleine Luftblasen können den Transferprozess unterbrechen und zu einem unvollständigen Transfer führen, wie hier an dem unteren Teil der Membran zu sehen ist.
Wenn der Transfer fertig angerichtet ist, lässt man ihn für 2-3 Stunden bei 20-30 mA laufen, nachdem zusätzlicher Transferpuffer zugegeben wurde. Der Transferpuffer enthält Methanol, was die Bindung des Proteins an die Membran erleichtert.
Nachdem der Transfer abgeschlossen ist, wird das „Sandwich“ auseinander gebaut. Die Qualität des Transfers kann mit Hilfe von Ponceau S, einem nicht spezifischen Farbstoff, kontrolliert werden. Dadurch kann man schnell und umkehrbar Proteinbanden erkennen.
Der erste Schritt im Immunblotting ist den restlichen Teil der Membran mit einer verdünnten Lösung von Proteinen zu bedecken. Dieser Schritt wird auch Blockieren genannt und wird ausgeführt um die Membran zu blockieren und dadurch nicht-spezifische Bindungen des Antikörpers zu der Membran einzuschränken. Normalerweise besteht die Blockierlösung aus bovinen Serumalbumin oder getrockneter Milch ohne Fettanteil, die in einer gepufferten Salzlösung aufgelöst ist. Dieser Schritt wird normalerweise eine Stunde oder über Nacht auf einem Schüttler durchgeführt.
Danach wird die Membran mit dem primären Antikörper, der in der Blockierlösung verdünnt ist, inkubiert. Dieser Schritt kann 30 min dauern oder über Nacht mit sanftem Schütteln ausgeführt werden.
Nun wird die Membran gründlich gewaschen um nicht-spezifsche Hintergrundsignale zu vermeiden. Danach wird ein sekundärer Antikörper, der in der Blockierlösung verdünnt ist, zu der Membran zugegeben. Nach kurzer Inkubationsdauer wird die Membran erneut gründlich gewaschen.
Sekundäre Antikörper können mit Hilfe von Reporterenzymen, die an sie gebunden sind, erkannt werden. Bei Zugabe des richtigen Substrats können Farbänderungen oder Chemilumineszenz abgebildet und mit densitometrischen Methoden gemessen werden. Zusätzlich stellt die Proteinleiter eine Größenreferenz für die Größe eines linearisierten Proteins dar, abhängig davon wie weit es im Gel relativ zu den Größenanzeigern der Leiter migriert ist. Das Beobachten der Größe von Proteinen im Immunblotting ist eine gute Methode um sicherzustellen, dass der Antikörper das richtige Protein erkennt und festzustellen ob es verschiedene Kopien dieses Proteins gibt.
Es gibt tausende von käuflich erhältlichen primären Antikörpern, die es einem erlauben spezifische Proteine in einer Probe nachzuweisen und zu quantifizieren. Hier verwendet ein Forscher einen HIF-1 α Antikörper um die Menge dieses Transkriptionsfaktors, der auf Sauerstoffänderungen reagiert, zu bestimmen und dadurch die Zellen auf Hypoxie zu untersuchen. Als Kontrollantikörper wurde beta-actin verwendet. Wie man hier sehen kann produzieren Zellen, die unter normalen Sauerstoffbedingungen kultiviert worden sind, bedeutend weniger HIF-1.
Die Kombination von 2D-Gelelektrophorese und Immunblotting ermöglicht es wichtige Informationen über die Existenz von Proteinkomplexen zu erlangen. Hier werden Proben zuerst nach der Größe der Komplexe aufgelöst und dann denaturiert, so dass jeder individuelle Proteinkomplex nach seiner Größe aufgelöst werden kann. Antikörper für drei verschiedene Proteine zeigen drei verschiedene Komplexe mit einer verschiedenen Anzahl dieser Proteine, die in einer vertikalen Linie angebracht sind. Die linke Spalte enthält beta-2 und MCP-21, sowie ein anderes Protein das nicht durch diese Marker gezeigt wird. Die mittlere Spalte zeigt einen Komplex mit allen 3 Proteinen, und die rechte Spalte enthält nur beta-2 und MCP-21.
Immunblotting kann auch benutzt werden um die Interaktionen von zwei Proteinen zu visualisieren. Das wird gemacht in dem man zuerst Proteine von einem Gel auf eine nitrozellulose Membran überträgt und diese Membran dann mit zusätzlichen Proteinen inkubiert. Immunblotting wird dann ausgeführt um zu erkennen, ob die zusätzlichen Proteine in einem Komplex mit Proteinen auf der Membran sind.
Das war die Einführung in das Immunblotting von JoVE. Ihr solltet nun verstehen wie man Proteine auf eine Membran transferiert, wie man die Membran mit Antikörpern inkubiert, und wie man ein Signal misst. Wie immer – danke für eure Aufmerksamkeit!
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