Summary
血小板粘附级联剪切流的存在，这个因素不占在常规（静态）以及板的检测。本文报道利用一个微井板格式，模拟生理剪切流条件的检测血小板聚集。
Abstract
血小板聚集发生在低于内皮细胞外基质已经暴露的血管损伤。血小板粘附级联剪切流的存在，这个因素不占在常规（静态）以及板的检测。本文报道利用一个微井板格式，模拟生理剪切流条件的检测血小板聚集。胞外蛋白，胶原蛋白I或血管性血友病因子使用气动泵的积极灌注微流体通道内沉积。基质蛋白，然后用缓冲液洗涤，并准备血小板相互作用的微流体通道封锁。用荧光染料标记的是全血灌流通过在不同的流量渠道，以达到血小板活化和聚集。血小板聚集抑制剂，可以添加之前生成的IC50剂量反应数据流细胞实验。
Protocol
第1部分：一个BioFlux板块的微流体通道的准备工作。
- 运行流细胞实验之前，需要准备与有兴趣的蛋白质涂层的微流体通道。在这种情况下，胶原蛋白，我将使用。每个通道都有一个入口和一个电源插座。对于这个板块，入口左侧，以及喂养的通道和出口的权利。
- 200μg/ml浓度0.02M醋酸稀释的Ⅰ型胶原（5mg/ml股票）涂层。一是将需要为每个使用的通道20μL。用微吸管尖混合温柔triteration。
- 添加20μL涂布到每个要使用相应的通道。必须免除液体以及喂养的微流体通道，使用微量的利益插座内打孔。避免引入气泡，不推空气的吸管。包括一个无胶原控制通道无胶原蛋白（阴性对照的粘附和聚集）。
- 第一紧缩的4个螺丝，然后一旦所有设置，使用的扭矩驱动程序完全收紧的手指，将接口板。扭矩驱动程序，单击时达到最大的密封性。
- 在BioFlux软件中使用手动模式，适用于灌注在2dyn/cm 2从电源插座以及利益的渠道。在这里，人们必须留意对面的内心充满液体的一拳。这将需要几分钟。一个可以观看此发生显微镜使用了低功耗的目标（4X），或板和进气口井从下面找到入口。首先应该看到的液体小珠，慢慢填补了内心的一拳。入口内打孔一旦被填满后，立即停止推动软件停止灌注。
- 板在室温下孵育一小时。
- 删除接口和电源插座以及添加1毫升的PBS（加的Ca 2 + / Mg 2 +的 ）。 2dyn/cm 2插座以及从开始灌注。继续灌注10分钟。停止灌注，并删除接口。
- 删除多余的PBS从入口和出口井 - 千万不要去除液体，填补了内心的一拳。用封闭液（0.5％V / V BSA在PBS（加的Ca 2 + / Mg 2 +的 ））座的渠道。加入封闭液1毫升，以每个插座以及用于灌注2dyn/cm 2插座。继续灌注10分钟。停止灌注，并删除接口。编制到这一步的通道，可使用一整天。
- 增加血液之前，取消对通道两侧的液体，除了内在拳。
第2部分。准备与GPIIb / IIIa受体抑制抗体的血。
- 虽然胶原蛋白是在孵化的渠道，就必须准备的全血。人们应遵循由他/她的研究所的生物安全法规处理时口授的人体血液。
- 绘制成柠檬酸钠抗凝新鲜人血（空腹个人）应收集3小时内使用。
- 准备加入4μm的钙黄绿素AM的血。准备一个4mm的股票和钙黄绿素在DMSO上午添加到血液稀释1 / 1000 V / V。混合轻轻翻转。
- 分配1毫升的钙黄绿素AM标示为10血 - 1.5ml的微管。 GPIIb / IIIa抑制剂抗体添加到每个所需的稀释液（IgG的分子量是〜150kDa）。一个例子稀释系列是从1200nm的9nM，包括一个没有抗体控制和无关抗体控制。 一个很好的抑制阳性对照，将ReoPro在20ug/ml浓度（阿昔单抗，礼来公司）。轻轻颠倒混合。
- 室温孵育1小时。轻轻颠倒混合，每10分钟。
第3部分：BF1000工作站上运行流细胞实验。
- 首先，必须建立在BioFlux控制模块自动协议。 Ⅰ型胶原，应该成立一个协议，运行10分钟从电源插座以及10dyn/cm 2 。在这一点上，人们还应该设置使用BF1000工作站的数据采集参数，包括通道位置，捕捉在FITC标记的波长和时间推移信息。它是建议捕捉到的视场，使用持续时间总共10分钟的每通道10倍的目标，每30秒。
- 工作迅速，成单独编制的渠道，500ul每个条件的准备血液。放置到一个通道，与胶原蛋白和一个只是被阻止涂没有抗体控制血压。
- 放在板的接口。
- 放置盘上BF1000工作站显微镜。钳接口上。
- 执行板负荷调整。此外，移动舞台，一个含有血液。设置金融时报IC图像采集参数（曝光时间，增益等... ...）。
- 在BioFlux蒙太奇软件中，开始收购，同时开始流和收购。
- BF1000工作站移除板，处理板根据机构指引。
第4部分：代表性的结果。
这里的血小板粘附和聚集在微流体通道的协议。血小板聚集抑制剂的治疗，anti-GPIIb/IIIa也包括在该协议。使用胶原蛋白涂BioFlux系统的微流体通道，应该会看到随着时间的推移积极与未经处理的控制血液样本和没有涂层通道上的血栓形成血栓形成。在最近进行的实验，总量控制的条件下的平均大小为 2000μm 2。
图1。 
活化的GPIIb / IIIa受体是血小板血小板的相互作用和聚合稳定 1有力的调解人。粘附于胶原激活GPIIb / IIIa受体复合物，引起这种反应2。 anti-GPIIb/IIIa孵化前1小时剪切曝光后，应观察减少血栓的大小，以及减少了血栓形成的频率。剂量依赖反应通常可以观察10dyn/cm 2。
图2。 
该IC 50值这个特定的抑制剂是17nM于2厘米/ DYN 10。最大抑制（此捐助）相比，没有抗体控制在10 DYN /厘米2为11％。
虽然这里的方法提出了使用特定的细胞外基质蛋白和血小板聚集的特异性抑制剂，该协议是扩展到其他涂料，其他类型的细胞和其他细胞粘附实验抑制剂。这种实验成功的关键因素是避免在微流体通道，在正确的稀释剂所有试剂的正确稀释，和适当的孵化条件，所有的试剂气泡。
Discussion
虽然这里的方法提出了使用特定的细胞外基质蛋白和血小板聚集的特异性抑制剂，该协议是扩展到其他涂料，其他类型的细胞和其他细胞粘附实验抑制剂。这种实验成功的关键因素是避免在微流体通道，在正确的稀释剂所有试剂的正确稀释，和适当的孵化条件，所有的试剂气泡。
Disclosures
撰稿人Fluxion Biosciences公司的员工。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| collagen I, Bovine | Reagent | Invitrogen | A1064401 | other sources of collagen I can be used |
| PBS plus Ca/Mg | Reagent | Invitrogen | 14040-117 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Reagent | EMD Millipore | EM-2930 Bottom of Form | From VWR |
| calcein AM | Reagent | Invitrogen | C1430 | Calcein AM from BD can also be used |
| BioFlux 1000 System | Reagent | Fluxion Biosciences | Contact Company | |
| BioFlux Plate | Reagent | Fluxion Biosciences | 900013 | |
| antiGPIIb/IIIa | Reagent | Abcam | ab33407 | an alternative # is ab15021 |
| ReoPro | Reagent | Eli Lilly | by Rx only |
References
- Jackson, S. P. The growing complexity of platelet aggregation. Blood. 109, 5087-5095 (2007).
- Nakamura, T., Kambayashi, J., Okuma, M., Tandon, N. N. Activation of the GP IIb-IIIa complex induced by platelet adhesion to collagen is mediated by both alpha2beta1 integrin and GP. VI. J Biol Chem. 274, 11897-11903 (1999).
