Summary
В этом видеоролике показано, как визуализировать аксонального пути генетически определенных групп нейронов в эмбриональном куриных спинного мозга использования
Abstract
Занятость элементов усилителя управлять выражением репортер генов в нейронах широко используется парадигма для отслеживания аксонального проекции. Для отслеживания аксонального проекции спинного интернейронов у позвоночных, зародышевой линии ориентированные гены репортер выход двусторонней симметричной маркировки. Таким образом, трудно провести различие между ипси-и контр-латерально проектирование аксонов. Односторонние электропорации в куриных нервной трубки является полезным средством для ограничения выражения гена-репортера с одной стороны центральной нервной системы, а также следовать аксонального проекции с обеих сторон
Protocol
И. Электропорация
Яйцо обработке
- Место яйца в увлажненных термостат до 37-38 ° С, предпочтительно инкубатор с качалки лотков.
- Эмбрион являются электропорации примерно через 66 часов инкубации, когда они достигли Гамбургер & Hamilton (HH) этап 18-20. На этой стадии руководитель находится под прямым углом к туловищу (состояние, которое называется шейный изгиб), а также обширный набор экстра-эмбрионального кровеносные сосуды, такие как передний, задний, правый и левый желточной вен должно быть видно. Это оптимальное почву для усилителя зависит от конкретного выражения 1,3,4. Важно контролировать температуру и влажность инкубатора, в целях получения жизнеспособного и синхронизированы эмбрионов.
- После 66 часов инкубации удалить яйца из инкубатора. Место яйца по горизонтали. Подождите 5-10 минут. Эмбриона сейчас находится на верхнем полюсе яйца.
Подготовка
- Подготовка решения Хэнка с пенициллина / стрептомицина (P / S) (1:100 разведение).
- Вытяните стеклянных капилляров (0,5 мм в диаметре), чтобы микрокапиллярных.
- Место электродов (вольфрам) в микроманипулятора и подключения электродов генератора импульсов (ECM 830).
- Настройте генератор импульсов со следующими параметрами: напряжение 30 В, количество импульсов - 3, длительность импульса 50 мс.
- Подготовка рот пипетки, шприца и лентой.
- Подготовка желаемой смеси ДНК (2-5μg/μl) и добавьте Быстрый зеленый краситель.
Оконная и электропорации
- Использование шприц, снимите 5-6 мл альбумина из каждого яйца.
- С маленькие ножницы открытым овальным окном в верхней части яйца.
- Влажный эмбриона с 0,5-1мл + Хэнка P / S решение.
- Используйте рот пипеткой, для загрузки стекла микрокапиллярных с ДНК смеси.
- Место эмбриона с хвостом к себе. На данном этапе, спинного мозга эмбриона хорошо видно. Следовательно, нет контрастных методов не требуется. Спинной мозг запечатана с обеих сторон, голова и хвост, но если ваш микрокапиллярных достаточно тонкий, вы сможете проколов маленькую дырочку и проникают в нервную трубку под небольшим углом. Микрокапиллярных права диаметр должен быть загружен с легкостью с ДНК, проникает трубку, не повреждая его и отпустите ДНК с регулярным выдох.
- Inject ДНК, используя рот пипеткой. Зеленая краска должна распространяться от кончика хвоста до пузырьков развивающийся мозг.
- Место электроды параллельно нервной трубки, так близко, как вы можете, не касаясь самой трубке и пульс. На момент импульса, электроды должны быть покрыты жидкостью для позволяющая электропроводности. Как правило, количество Хэнка добавлены в попрошайничество является достаточным. Если бы не добавить одну каплю непосредственно перед Хэнка, чтобы пульс.
- Осторожно снимите электроды и печатью окно с лентой. Важно, чтобы запечатать яйцо целиком, чтобы предотвратить высыхание эмбриона в течение следующего периода инкубации.
- Положите яйцо обратно в инкубатор.
II. Спинной мозг открытой книги подготовке
Отряд спинного мозга от эмбриона
- Удалить eletroporated эмбриона, в E6, с яйцом и поместить его в чашку Петри с силиконовым покрытием содержащие PBS.
- Срежьте мембран и растянуть эмбриона на его вентральной стороне использованием контактов, чтобы держать это.
- Используя острый вольфрама микрокапиллярных сделать продольный разрез вдоль крыши пластины, из заднего мозга вплоть до хвоста.
- Сделайте еще два продольных разреза по обе стороны от спинного мозга, отсоединение спинной ганглий корня (ДРГ) от спинного мозга.
- Отсоедините плиты перекрытия из ткани, начиная от хвоста до заднего мозга, в результате чего спинной мозг неповрежденным.
- Вырезать спинного мозга в поперечном сечении на задний мозг с использованием тонких ножниц и отделить его от тела.
Фиксация
- Распространение изолированных спинного мозга в новой чашки Петри с силиконовым покрытием содержащей PBS, используя контакты, чтобы провести его, от заднего мозга к хвосту производству плоского монтажа подготовки.
- Налейте PBS с блюдом и заменить его на 4% параформальдегида в фосфатно-солевой буфер.
- Инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 часа.
Иммуногистохимия
- Передача фиксированного спинного мозга в флакон, содержащий первичных антител в PBS.
- Инкубируйте с нежным волнений в течение ночи при 4 ° C.
- Вымойте антител X5 раз PBS, каждого мытья в течение 1 часа с нежным волнения.
- Добавить вторичными антителами и инкубировать с нежным волнений в течение ночи при 4 ° C.
- Вымойте антител X5 раз PBS, каждыймыть в течение 1 часа с нежным волнения.
Монтаж открытой книгой для работы с изображениями
- Мазок смазки или силикона в прямоугольник на слайде и капать в PBS.
- Место спинной мозг растягивается в середине прямоугольника с помощью пинцета и вытянуть жидкость вокруг него при помощи пипетки Пастера.
- Место 1-2 капли монтажа средств массовой информации на спинной мозг и накройте покровным стеклом. Сквош его, чтобы избежать воздушных пузырей.
- Хранить в темном слайды в 4 ° С.
- Осмотрите спинного мозга с помощью конфокальной микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Электропорация плазмидной ДНК в куриных эмбрионах, как развивается мощная техника для прижизненного эктопической экспрессии. Сочетание конкретных усилителей, а также куриных электропорации обеспечивает быстрый и эффективный инструмент для расшифровки аксонального пути генетически определенной группы нейронов 1,3,5. Используя Cre / LoxP и системы Gal4/UAS усиления может увеличить уровни и продолжительность выражения. Складывающаяся картина носит сложный расхождение аксонального сигналы, которые возникают из интернейронов субпопуляций, определяется направление их аксонального прогнозы. Кроме того, одновременное молекулярной и пространственной ограниченной маркировка из двух нейронных популяций может быть достигнуто. Таким образом, предоставление информации об архитектуре нейронных схем 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами для АК от Израиля научный фонд, Министерство здравоохранения Израиля и DFG (Немецкий исследовательский фонд).
References
- Zisman, S., et al. Proteolysis and membrane capture of F-spondin generates combinatorial guidance cues from a single molecule. J Cell Biol. 178 (7), 1237-1249 (2007).
- Arakawa, T., Iwashita, M., Matsuzaki, F., Suzuki, T., Yamamoto, T. Paths, elongation, and projections of ascending chick embryonic spinal commissural neurons after crossing the floor plate. Brain Res. 1223, 25-33 (2008).
- Avraham, O., et al. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1. Neural Dev. 4 (1), 21 (2009).
- Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers. Genesis. 29 (3), 123-132 (2001).
- Reeber, S. L., et al. Manipulating Robo expression in vivo perturbs commissural axon pathfinding in the chick spinal cord. J Neurosci. 28 (35), 8698-8708 (2008).
