Summary
Это видео показывает протокол изоляции и культуры пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVEC) от человеческой пуповины. После выделения этих клеток могут быть использованы для экстракорпорального ангиогенеза анализы, как оптимизированная фибринового геля из бисера Анализ также свидетельствует лаборатории Hughes.
Abstract
Ангиогенез представляет собой сложный многоступенчатый процесс, где в ответ на ангиогенных стимулы, новые суда создаются из существующих сосудов. Эти шаги включают в себя: деградации базальной мембраны, пролиферации и миграции (прорастание) эндотелиальных клеток (ЕК) в внеклеточного матрикса, выравнивания ЕС в шнуры, просвет образования, анастомоза, и формирование новой базальной мембраны. Многие в пробирке тесты были разработаны для изучения этого процесса, но большинство лишь имитируют определенные этапы ангиогенеза, и морфологически судов часто не похожи на судах в естественных условиях. Здесь мы показываем, оптимизированных в пробирке ангиогенеза анализа, который использует пупочной вены человека ЕС и фибробластов. Эта модель повторяет все ключевые ранней стадии ангиогенеза, и, что важно суда дисплей патент межклеточных люмен окруженной поляризованной ЕС. Суда могут быть легко наблюдать фазового контраста и покадровой микроскопии, а также взысканы в чистом виде для последующих применений.
Protocol
Процедура
- Положите шнур на чистую площадку и промокните лишнюю кровь. Сделайте свежие порезы на обоих концах кабеля.
- Вставьте 21 1 / 2 G иглу с иглы пластиковый чехол ON, в вену. (Вены является крупнейшим открытием; 2 небольших них артерий)
- Зажим иглу в месте с кровоостанавливающего и приложите 20cc шприц Хэнкс на иглу.
- Нажмите Хэнкс через вену с умеренным давлением. Сбор отходов в стакан с хлоркой. (Холдинг иглу и шнур с одной стороны, выдвигая помешает иглы выкатились из вены.) Если есть много крови в вене, мыть второй раз.
- Положите шнур на площадку и зажим другой конец вены. Залейте несколько мл Хэнкс и проверить на наличие утечек вдоль шнура. Вывод 5 мл и отсоединить нижний зажим.
- Отключите 20cc шприц. Удалите поршень из 10cc шприц. Прикрепить 10cc шприц иглой, заливают в 10 мл коллагеназы и заменить поршень. Нажмите коллагеназы в вену, пока не появится первая сумма выхода открытый конец. Re-зажим открытым концом и залейте коллагеназы, пока не будет умеренным вздутие вен. Слишком много растяжение приводит к загрязнению гладкие мышцы.
- Массаж шнур мягко.
- Инкубируйте мозга (с hemostats, игл и шприцев прилагается) в DPBS при температуре 37 ° С в течение 15 мин.
- Хотя инкубации, продолжают шаги 1-8 с 2-го мозга.
- После инкубации взять шнур из стакана и, удерживая шнур в течение 50 мл трубки вырезать конца выше нижнего зажима. Будьте уверены, чтобы собрать все, что в трубке. Нажмите оставшиеся коллагеназы через шнур, затем приложите 20cc шприц и нажмите Хэнкс через с умеренным давлением.
- Если не гладкомышечных клеток необходимы, отказаться от мозга на этот раз. В противном случае, место же шнур во второй 50 мл трубки с ~ 5 мл коллагеназы и инкубировать при 37 ° С в течение 30-60 мин.
- Держите трубку, пока все шнуры сделаны.
- Спиновые труб при ~ 1200 оборотов в минуту в течение 5 мин.
- Аспирируйте супернатант (за исключением ~ 1-2 мл). Ресуспендируют пеллет в 5mls PHEC + и пластины в T25.
- Инкубировать при 37 ° C с 5% CO 2 за одну ночь.
- На следующий день удалить супернатант и заменить свежей информации. Если Есть много эритроцитов, мыть один раз с M199, затем добавить PHEC +. Продолжить инкубации, как обычно, пока пластина сливной (1-4 дней). Разделить на желатинизированный T75.
- После T75 является вырожденным, разделен на три T75s. Замораживание два флакона в колбу.
Примечание: эндотелиальных клеток (неактивированных) имеют вид булыжника. Эндотелиальных клетках иногда активирован (длинные и заостренные) сразу после изоляции, после нескольких проходов они обычно возвращаются в неактивное состояние.
Уборка
- Очень осторожно, распоряжаться иглы в контейнере острых предметов.
- Утилизация шприцев в большой контейнер для биологически опасных.
- Положите все ткани в небольшой сумке биологической опасности. Закройте пакет и заморозить при -20 ° до сжигания.
- Замочить всех инструментов в virucide по крайней мере 10 мин.
- Добавить инкубации СМИ отходов / отбеливатель стакан. Дайте настояться в течение 10 мин.
- Отменить скамейке прокладки в биологически опасных отходов.
- Спрей вниз внутри и снаружи стаканы, настольный и крышка водяной бане с vircide. Дайте настояться 10 минут, затем протереть.
- Промыть стаканы и приборы с теплой водой и повесить на стойку для сухой (пятно от инструментов, чтобы они не ржавеют).
- Утилизация отходов дезактивации в раковину.
- Возврат неиспользованных средств массовой информации в холодильник.
- Утилизировать перчатки в биологически опасных отходов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% Collagenase | 10 mL per cord, warmed to 37 °C | ||
| Tissue culture flasks | T75, one per cord. | ||
| Hanks medium | |||
| scissors | sterile | ||
| beaker | sterile | ||
| 50 mL tubes |
