Summary
פרוטוקול הבא מתאר את התהליך של דיסקציה הלבלב הדמיה פרוסה וירטואלית, ועל כימות הבאים של כל ה-GFP-tagged בתאי בטא בלבלב כולו.
Abstract
האיתור שינויים של אוכלוסיות תאים ספציפיים בבריאות ובחולי היא מטרה חשובה של מחקר ביו. תהליך שגשוג התא בטא בלבלב ניטור צמיחה איון הוא מאתגר במיוחד. פיתחנו שיטה כדי ללכוד את חלוקת בטא בלבלב תאים שלמים של העכברים הטרנסגניים עם הקרינה-tagged בטא תאים עם מאקרו נכתב עבור ImageJ (rsb.info.nih.gov / ij /). בעקבות לנתיחה הלבלב וניקוי רקמות הלבלב, כולו נתפס כמו פרוסת וירטואלי, שלאחריו GFP-tagged בטא התאים נבדקות. הניתוח כולל את כימות המספר הכולל תא בטא, איון אזור והפצה גודל תוך התייחסות לפרמטרים מיקומים ספציפיים עבור כל איון עבור אשכולות קטנים של תאים בטא. הפצה כולו של איונים ניתן להתוות בשלושה ממדים, וגם את המידע על התפלגות גודל וצורה של איון כל מאפשר השוואה כמותית ואיכותית של שינויים באזור בטא תא הכוללת במבט אחד.
Protocol
חלק 1: הכנת דוגמאות
- המקום עכבר תחת מיקרוסקופ לנתיחה, להסיר את הלבלב כולו יחד עם התריסריון והטחול עדיין מחוברת, והמקום איברים בשקופית זכוכית טרום שקל. הסר את התריסריון על ידי חיתוך הרקמה החיבורית שלה בצד שבו הוא חייב הלבלב. גזור להסיר את הטחול ואת עודף שומן על הלבלב עד הלבלב הוא מבודד לחלוטין בשקופית. (שומן הלבלב הוא להבחין לפי הצבע הלבן שלה, להבדיל מהצבע מעט כהה לשיזוף של רקמת לבלב).
- מניחים coverslip (זכוכית לכסות גדול 50x75mm; תקן זכוכית לכסות 25x75mm) על הלבלב, כך שהוא מכוסה לחלוטין. השתמש במשקל (למשל ספר כבד) לשטח את הלבלב בין שקופיות ואת העטיפה. בהתאם למשקל, משטחת את הלבלב לוקח בערך חמש דקות.
- תוריד את המשקל. אם הלבלב היטב שטוח מול המגלשה, למקם אותו paraformaldehyde 4% (PFA) ב 4 ° C למשך הלילה. בבוקר, להסיר את coverslips היטב לחשוף את הלבלב כולו PFA במהלך היום (6-8 שעות). אם הלבלב אינו היטב קבוע, לאפשר לו להישאר PFA יותר, ואולי גם לילה. העברת שקופיות המיכל עם 1% Triton x-100 ב פוספט בופר סליין (PBS) לילה. למחרת, העברת שקופיות מכולה של סוכרוז רווי במשך 1-2 ימים. ואז להעביר את השקופיות למיכל של גליצרול 100% עד הרקמה אינה מסומנת, אשר מאפשר לפתרון אופטימלי של אותות ניאון, ניקוי הרקמה לוקח כ 1-3 ימים. (אותות ניאון עלולה להימשך שבועות ואף חודשים, אך הדמיה יש לבצע מיד לאחר הרקמה מנוקה לפתרון האופטימלי.)
- אחסן את הלבלב באזור חשוך וקריר על מנת לשמר את האיבר ואת אותות ניאון שלה.
חלק 2: הדמיה לכימות באזור תא בטא בלבלב שלם
- באמצעות מלקחיים או כפות ידיים בכפפות, לקחת את השקופית מתוך המיכל עם גליצרול 100%. הכן את השקופית הדמיה על ידי מנגב את עודפי גליצרול בלעדי ניקוי האחורי של מכסה זכוכית עם אתנול.
- פתח את תוכנת StereoInvestigator (MicroBrightField, Williston, VT) ובחר את העדשה אובייקטיבי 2x לעכברים הדמיה pancreata מעל גיל 3 שבועות בשקופיות זכוכית גדול, או את העדשה אובייקטיבי 10x עבור עכברים הדמיה pancreata צעיר מכפי 3 שבועות לחוץ בין שני 25mm coverslips. דמיינו את התמונה על ידי קביעת זה לחיות תמונה (Image → תמונה חיה). בחר זמן חשיפה כי מראה בבירור את ה-GFP-tagged בטא תאים. (Underexposing את התמונה כולל איים קטנים בטא תאים, בעוד overexposing את התמונה יוצרת אותות שווא נוספות.)
- לחץ בכל מקום על המסך כדי להקים נקודת התייחסות ולהמשיך לצייר קו מתאר סביב הלבלב כולו. ליזום את תהליך Slice וירטואלית (תמונה → רוכשת Slice וירטואלי). קבע ובחר את הטובים ביותר, כלומר משטח הפוקוס, את המטוס עם המספר הגבוה ביותר של איים גלוי ממוקד בטא תאים על ציר ה-Z על ידי גלילה את כפתור המיקוד. נבחר פעם אחת, StereoInvestigator באופן אוטומטי לוכדת את התמונה המוצגת על המסך. עם הבמה ממונע, התכונה Slice וירטואלי ברצף לוכדת כל פאנל אופטי כתמונת נפרדים בתוך קונטור סגורים (איור 1A) ולאחר מכן משלבת את כולם כמו תמונה אחת הממוזגת (איור 1B). הדמיה Slice Virtual משתמש תצורה epifluorescent כלומר, widefield מסננים אשר מאפשרת המצלמה כדי ללכוד את כל אותות נוכח עומק מסוים, כולל אלה לא לגמרי בפוקוס, כך פורסים וירטואלי הסופית היא תמונה משולבת דו מימדי שאינו מקסימלית הקרנת שחזור תלת ממדי של הלבלב כולו. סריקה ממוצע וירטואלי זמן Slice הוא 30 דקות לפי המדגם, אך יכול לקחת עד שעה עבור הלבלב גדול.
- לאחר שמירת התמונה, להתחיל את הניתוח שלה על ידי פתיחת התמונה עם ImageJ. כאשר התמונה מסיים טעינה מופיע על המסך, לפתוח ולהפעיל את Slice וירטואלי ניתוח מאקרו ( חומר משלים 1 ).
- עקוב אחר צעד אחר צעד ההוראות שסופקו על ידי המאקרו. סלקו חפצים לא רצויים שנוצרו על ידי פיזור אור עם "שרביט קסמים" ו "בחר שטח" כלים. בדוק ולחסר רקע מיותרים מהתמונה. קבע את הרדיוס של איון הגדול עם הכלי "הקו", כך תכונה שלאחר מכן כדור הרולינג יכול למעשה להסיר אור autofluorescence והתפזרו. מבחן ולבחור את המתאימים ביותר "סף נמוך" כדי ללכוד את אותות ניאון של איונים קטנים ואשכולות של תאים בטא (<3x10 4 מיקרומטר 2). מבחן ולבחור את המתאימים ביותר "סף גבוה" כדי ללכוד את אותות ניאון של איים. הפעל את כימות פורסים את הוירטואלי, אשר ימדודלייצר רשימה של אזור עוטף איון, מעגליות, ואת קוטר של Feret.
איור 1 א תמונה וירטואלית Slice ניתוח של חלוקת כל בטא תאים בלבלב מבוגר ללא פגע
תמונות של לוחות אופטי יחיד של הלבלב עכבר זכר ב 10-wk נלקח תחת מטרה 2x. התמונות כוללות את כל הפצה של איים, אפילו אשכולות קטנים של תאים בטא (<10 תאים).
איור 1B תמונה וירטואלית Slice ניתוח של חלוקת כל בטא תאים בלבלב מבוגר ללא פגע
פרוסת וירטואלית מאוחד עם הלבלב הגבי מימין הלבלב הגחון בצד שמאל. בר סולם הוא 5 מ"מ.
נציג תוצאות
הכנה מיומן של הלבלב הדמיה Slice וירטואלי תאפשר כימות יעיל של כל ה-GFP-tagged בתאי בטא בלבלב שלם כתמונת Slice וירטואלי עם איים ברורה וייחודית. פורסים מוצלח הדמיה וירטואלית של הלבלב שלם באתרו מספק את האמצעים לבחון ולכמת את בטא תאים, לא רק בתחום הפרט איון מוחלט, אלא גם גודל ההפצה איון, ניתוח אזורית, דפוסי צמיחה גם כן. בעוד ImageJ שומרת את היכולת לזהות את כל בטא תאים בו זמנית בניתוח תמונות Slice וירטואלי, הוא יכול גם לשלוט בטא תאים לכמת ידי הגבלת ניתוח בגדלים מסוימים איון (לפי אזור או קוטר), או לפי מיקום. ניתוח סטנדרטי כולל חפצים כגון פסולת קטן יותר מאשר תא אחד בודד בטא (<170 מיקרומטר 2) ורשומות האזור, היקף (המרחק סביב שטח), המעגליות (מידה של עגלגלות, שבה 1.0 מייצגת עיגול מושלם), ו בקוטר של Feret (המרחק הארוך ביותר בתוך שטח) עבור איון כל זוהה. ניתוח Slice וירטואלי הוא מסוגל לשפר את התמונות פרוסה וירטואלית על ידי העסקת פילוח פרשת המים, אשר מבדיל ומפריד איים חופפים לתוך איים בודדים על פי צורתם. ניתוח נוסף מייצרת סדרה של תמונות מפורטות, זה כולל מסכות של התמונות הן תחת עוצמת נמוך וגבוה (איור 1C), קווי המתאר של כל האיונים חזקה, אשר כל מנה בנפרד בטבלה של מידע המתאים (איור . 1D), וכן את התמונה המקורית Slice וירטואליים (איור 1B). שים לב, הטיה טכני פוטנציאל בבחירת ערכי הסף יכול להטות כימות של איים על ידי כולל אור מיותר סביב מבנים גדולים, או על ידי הקטנת המספר הכולל של איים, אותות חלש במיוחד של חלקיקים קטנים.
איור 1C תמונה וירטואלית Slice ניתוח של חלוקת כל בטא תאים בלבלב מבוגר שלם
מסכה של חלקיקים ניאון פרוסה הווירטואלי. קודי צבע: [1] כחול: הקרינה בעצימות נמוכה, [2] ירוק: עוצמת הקרינה ביניים, ו [3] אדום: הקרינה בעוצמה גבוהה.
איור תמונה 1D וירטואלי Slice ניתוח של חלוקת כל בטא תאים בלבלב מבוגר ללא פגע
כימות איים בודדים / אשכולות של בטא תאים. שים לב שכל איון (כולל קבוצות קטנות של תאים בטא) ממוספר, עם מידע מפורט שלה בתרשים המקביל. ארבעה פרמטרים נלקחו כל מבנה: (1) אזור, (2) המערכת; (3) המעגליות: מידה של עגלגלות שבו מספר 1.0 מייצגת עיגול מושלם; ו (4) בקוטר של Feret: המרחק הארוך ביותר בתחום. שימו לב # 706 מציג את הרזולוציה מנתח עם שטח של רק בטא תאים בודדים. פילוח פרשת המים מזהה קבוצות של איים סמוכים, כמו זה המוצג, הולם מבדיל אותם איים נפרדים (איים 1554, 1555 ו 1556).
איור 1E תמונה וירטואלית Slice ניתוח של חלוקת כל בטא תאים בלבלב מבוגר ללא פגע
3 מימדי המגרש של הניתוח פרוסה וירטואלית, עם צירים של האזור, היקף בקוטר של Feret. כל נקודה מייצגת איון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניתוח של תמונות Slice וירטואלי של איים וביתא תאים בלבלב אשכולות שלמים מספק תצוגה רחב היקף של חלוקת כל האיונים. התפתחויות ושינויים בחלוקת איון מוחלט לאורך זמן ולכן יכול להיות למד בהשוואה. כזה למשל הוא הפגינו הניתוח שלנו של היווצרות הלבלב איון (1). ניתוח מקיף של pancreata עכברים בילוד בנקודות זמן שונות (P1-p21) הוכיחה כי איים נוצרות על ידי ביקוע. בעוד בטא התפשטות תאים מתאים פונקציה צפיפות ההסתברות lognormal בעכברים מ P1-P10, הפצה איון ואילך P12 סוטה שמאלה מן הדפוס lognormal, דבר המצביע על תהליך של ביקוע. ניתוח דומה בוצע על פיתוח insulinoma פרוגרסיבי בעכברים, אשר מצויד פונקציה lognormal עם פרמטרים של מיקום שיא ציר x סולם, ואת חוק כוח הפצה (2): 
P (x) = ax y. הנתונים מוצגים ביעילות תלת ממדי חלקות באזור ההיקפי בקוטר של Feret (איור 1E). לצורך המחקר שלנו, העכברים הטרנסגניים, שבו תאים בטא בלבלב תויגו גנטית עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP, 3, 4) תחת שליטה של אינסולין עכבר אני מקדם (MIP), היו בשימוש. MIP-GFP יכול להיות גם עם אחרים חצו העכברים הטרנסגניים ספציפי במחקרים עתידיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחקר נתמך על ידי ארצות הברית השירות לבריאות הציבור של גרנט DK-081527, 072473 ו DK-DK-20595 של אוניברסיטת שיקגו סוכרת מחקר מרכז הדרכה (Core מודלים בבעלי חיים), ואת מתנת קרן משפחת קובלר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Miltex Inc. | ||
| Scissors | F.S.T. | 14001-13 | 01n2 |
| Scissors | F.S.T. | 14072-10 | 02s5 |
| Large glass slide | Electron Microscopy Sciences | 71862-01 | 75x51x1.2mm |
| Large cover glass | Ted Pella, Inc. | 260462 | 50x75mm |
| Glass Slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1.0mm |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-458-5M | 75x25mm |
| Cover glass | Erie Scientific | 25mm circle | |
| Fluorescent microscope | Olympus Corporation | ||
| Dissection microscope | Olympus Corporation | ||
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| MIP-GFP mice | Jackson Laboratory |
References
- Miller, K., Kim, A., Kilimnik, G., Moka, U., Jo, J., Periwal, V., Hara, M. Islet formation during the neonatal development in mice. PloS One. 4, E7739-E7739 (2009).
- Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).
- Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).
- Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).
