Summary
يمكن استنساخها الذاتية التهاب النخامية في الفئران عن طريق حقن مستخرج من البروتينات النخامية الماوس.
Abstract
التهاب النخامية الذاتية هو التهاب مزمن في الغدة النخامية أو بسبب المناعة الذاتية مصحوبة 1. وقد جرت العادة على اعتبار أنه مرض نادر ولكن التقارير قد ازداد بشكل ملحوظ في السنوات الأخيرة. التهاب النخامية ، في الواقع ، لم يتطور بدرجة غير عادية باعتبارها "الآثار الجانبية" في علاج مرضى السرطان مع الأجسام المضادة التي تعمل على منع المستقبلات المثبطة وأعرب عن الخلايا اللمفية تي ، مثل CTLA - 4 2 ومستقبلات PD - 1. يمكن أن يتسبب التهاب النخامية الذاتية تجريبيا عن طريق حقن الفئران مع البروتينات النخامية مختلطة مع مساعد 3. في هذه المقالة الفيديو نظهر كيفية استخراج البروتينات من الغدد النخامية الماوس وكيفية التحضير لها في شكل مناسب لإحداث التهاب النخامية في الفئران SJL الذاتية.
Protocol
البروتوكول التجريبي
الخطوة الأولى في هذا البروتوكول التجريبي هو جمع عدد كبير من الغدد النخامية الماوس. الخطوة الثانية هي التجانس الغدد إعداد استخراج البروتين. الخطوة الثالثة هي لاستحلب هذه البروتينات مع المزيج الزيتي.
خطوة 1 : جمع وتخزين الغدد النخامية الماوس
الغدة النخامية الماوس يجلس في قاعدة الجمجمة في منخفض من العظم الوتدي تسمى السرج التركي ، وتحيط بها أفقيا والأعصاب الثلاثي التوائم الأمامية قبل chiasm البصرية. وتتألف الغدة من الفص الأمامي أكبر وأصغر الفصوص الخلفية والمتوسطة ، ويزن 1.9 ملغ في المتوسط. وتجمع الغدد النخامية من الفئران من سلالات مختلطة من الجنسين ، والأعمار ، والمتجهة إلى يتم التخلص من الحيوانات مرفق الرعاية.
لعزل الغدة النخامية ، والموت الرحيم للفأرة ، والجلد فوق تشريح الجمجمة وعظام الجمجمة قطع مفتوحة مع المقص. رفع الدماغ للكشف عن الغدة النخامية ، وهي معزولة ثم من الأم الجافية المحيطة بها ، وحصد من العظم الوتدي وتخزينها في أنبوب من البلاستيك على الثلج الجاف.
بشكل عام نحن نستخدم الماوس الغدد النخامية 300 لإعداد بروتين واحد ، وهو الرقم الذي يمكن تحصيلها من قبل شخص واحد في 9 ساعات.
بمجرد الانتهاء من جمع وتخزين أنبوب يحتوي على الغدد النخامية عند -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة للخطوة التالية.
الخطوة 2. استخراج البروتينات النخامية الماوس
- أبقى إضافة إلى التجانس العازلة أنبوب فالكون 15 مل (أي 352059 التسويقي) في حمام الثلج ، وذلك باستخدام 250 ميكرولتر من العازلة لكل الغدد النخامية 100 التي تم جمعها. استخدام القوة العازلة الأيونية مماثلة لتلك التي موجودة من الناحية الفسيولوجية داخل سيتوبلازم الخلية (0.2 م) والرقم الهيدروجيني الفسيولوجي (7.4). نستخدم الفوسفات مخزنة المالحة (0،161 م ، ودرجة الحموضة 7.4) ، على أن تستكمل مع مثبط البروتياز الكوكتيل (سيغما الدريخ ، وأنواع لا P8340 - 1ML).
- إضافة إلى الغدد النخامية العازلة قبل التجانس ، ثم ضع مولد (5 ملم قطر) من الخالط Polytron في الجزء السفلي من الأنبوب من طراز فالكون. التجانس في الدقيقة كحد أقصى لمدة 30 ثانية ، وتتحرك بلطف أنبوب فالكون صعودا وهبوطا مع إبقائها في حمام جليدي. ثم ، ضع جناسة على الجليد لمدة 1 دقيقة. كرر الخطوات من التجانس والتبريد مرتين أخريين. ينبغي لهذا التجانس طيف كسر الخلايا والافراج عن البروتينات عصاري خلوي دون تعطيل النوى.
- لإزالة النوى ، والأنسجة والمواد غير القابلة للذوبان متواصلة (مثل النسيج الضام ومجمعات البروتين المعطل) ، أجهزة الطرد المركزي لجناسة بسرعة منخفضة (1000g) لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- نقل طاف (التي تسمى الآن في مرحلة ما بعد النووية الطافي (Supernatant) ، PNS) إلى أنبوب فالكون الجديدة ، مع الحرص على ترك بيليه دون عائق ، وتخزين PNS على الجليد.
- Resuspend الكرية في حجم الأصلي للتجانس العازلة (250 ميكرولتر من العازلة لكل الغدد النخامية التي جمعت 100) ، على النحو الوارد أعلاه التجانس ، الطرد المركزي على النحو الوارد أعلاه ، ومن ثم الجمع بين PNS الثاني مع الأول.
- قسامة اثنين تجميع العينات في أنابيب PNS microcentrifuge وتخزينها في -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة للخطوة التالية. يمكن تخزين هذا البروتين في إعداد -80 درجة مئوية ولكن يفقد فعاليته تدريجيا ، ولذا فإننا نوصي لاستخدامه في غضون 6 أشهر من التحضير. استخدام قسامة صغيرة لتحديد العائد من البروتين والتركيز من قبل مقايسة BCA (بيرس كتالوج رقم 23225) ، ونوعية البروتين هلام إستشراد. بشكل عام ، ونحن الحصول على نحو 60 ملغ من البروتين من 300 pituitaries الماوس في 1.5 مل من التجانس العازلة ، بتركيز حوالي 40 ملغ / مل.
الخطوة 3. إعداد مستحلب للتمنيع
- ذوبان الجليد بسرعة aliquots البروتينات اللازمة لتجميد التجربة وضبط تركيز البروتين إلى 20 ملغ / مل. وسيتم استخراج هذا البروتين مستحلب 01:01 فرويند الكامل مع المصاحب لل(CFA ، سيجما F - 5881) تحتوي على 5 ملغ / مل من الحرارة قتل المتفطرة السل (بيكتون ديكنسون ، 231141). وسوف تتلقى كل الماوس 1 ملغ من مستخلص الغدة النخامية في 100 ميليلتر من مستحلب.
- على سبيل المثال هنا هو إعطاء لتحصين الفئران 10 ، حيث سيتم حقن كل الفأر مع 100 ميكرولتر من مستحلب تحتوي على 1 ملغ من البروتينات في الغدة النخامية. تسمح لاثنين الفئران اضافية عن الخسائر المادية أثناء إعداد ، وذلك باستخدام 12 ملغ من البروتينات في الغدة النخامية. يطمح 600 ميكرولتر من 20 ملغ / مل استخراج البروتين النخامية وصف أعلاه باستخدام 2.5 مل حقنة gastight هاملتون. Resuspend اتفاق وقف اطلاق النار من جانب والهز ، ويطمح 600 ميكرولتر من CFA إلى آخر حقنة هاميلتون 2.5 مل. إرفاق وتأمين عيار 22 الصغرى الاستحلاب الإبرة إلى حقنة مليئة CFA. دفع ببطء المكبس من المحاقن CFA بحيث يتم تعبئة الإبرة مع CFA ، ثم نعلق وتأمين الطرف الآخر منالإبرة إلى حقنة مليئة استخراج الغدة النخامية.
- يتقدم ببطء المكبس من المحاقن CFA لدفع النفط الى عنصر استخراج الغدة النخامية acqueous ، بحيث يتم خلط كمية صغيرة فقط. ثم دفع المكبس الخلفي من الحقنة استخراج الغدة النخامية في حقنة CFA. كرر هذا الإجراء زيادة تدريجية في كمية المواد المختلطة. تستمر حتى يتم خلط المحتوى بالكامل من المحاقن اثنين. سوف تحصل على حل بيضاء وزعت بالتساوي الذي يمثل الماء في مستحلب النفط.
- بمجرد أن يتم تشكيل مستحلب ، كرر الحركة ذهابا وإيابا على الأقل 500 مرة لضمان خلطها بشكل تام المستحلب. بعد دورة خلط النهائي ، 01:01 المياه في ومستحلب النفط جاهزة للاستخدام وتحتوي على تركيز البروتين النخامية من 10 ملغ / مل. وسيتم حقن مستحلب في اليوم نفسه تحت الجلد في الفئران SJL تخدير ، على النحو المفصل في المادة الرفيق إن الرب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من حقيقة ان تم الابلاغ عن اول مريض مع التهاب النخامية الذاتية في عام 1962 4 ، والمسببة للأمراض الغدة النخامية autoantigens لا يزال يتعين تحديدها 5. نماذج حيوانية يمكن أن تكون مفيدة جدا لتحديد هذه autoantigens ، والمساعدة في اكتشاف المؤشرات الحيوية التي هي ترجمة لرعاية المرضى. وقد أثبتت هذه المقالة إجراء مبسط لإعداد البروتينات النخامية في شكل غير كافية لإحداث التهاب النخامية الذاتية في حيوانات التجارب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح DK080351 إلى الكمبيوتر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15-ml Falcon tubes | |||
| homogenization buffer | |||
| phosphate buffered saline | |||
| protease inhibitor cocktail | |||
| Polytron homogenizer | |||
| BCA assay | Pierce, Thermo Scientific | 23225 | |
| Complete Freund’s Adjuvant (CFA) | Sigma-Aldrich | F-5881 | |
| Mycobacterium tuberculosis | BD Biosciences | 231141 | |
| 2.5 mL Hamilton gastight syringe | |||
| 22-gauge micro-emulsifying needle |
References
- Caturegli, P., Newschaffer, C., Olivi, A., Pomper, M. G., Burger, P. C., Rose, N. R. Autoimmune Hypophysitis Endocr Rev. 26, 599-614 (2005).
- Blansfield, J. A., Beck, K. E., Tran, K., Yang, J. C., Hughes, M. S., Kammula, U. S., Royal, R. E., Topalian, S. L., Haworth, L. R., Levy, C., Rosenberg, S. A., Sherry, R. M. Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4 blockage can induce autoimmune hypophysitis in patients with metastatic melanoma and renal cancer. J Immunother. 28, 593-598 (2005).
- Tzou, S. C., Lupi, I., Landek, M., Gutenberg, A., Tzou, Y. M., Kimura, H., Pinna, G., Rose, N. R., Caturegli, P. Autoimmune Hypophysitis of SJL mice: Clinical Insights from a New Animal Model. Endocrinology. 149, 3461-3469 (2008).
- Goudie, R. B., Pinkerton, P. H. Anterior hypophysitis and Hashimoto's disease in a woman. J Pathol Bacteriol. 83, 584-585 (1962).
- Caturegli, P. Autoimmune hypophysitis: an underestimated disease in search of its autoantigen(s). J Clin Endocrinol Metab. 92, 2038-2040 (2007).
