Summary
وصفنا а بروتوكول للعزلة من الذهب الخالص ، والقلب الفئران المقرون بدرجة عالية الميتوكوندريا للدراسات وظيفية أو هيكلي من الطاقة الحيوية الخلوية ، والقياسات البيولوجية والفيزيائية ، البروتيوميات أو الحمض النووي وتحليل الدهون.
Abstract
ومن المعترف به على نطاق واسع وظيفة الميتوكوندريا في توليد ATP الخلوية في عملية الفسفرة المؤكسدة. خلال العقود الماضية لم يكن هناك تقدم كبير في فهمنا لوظائف أخرى من الميتوكوندريا توليد الطاقة. وتشمل هذه دورها في موت الخلايا المبرمج ، بوصفها إشارات العضيات ، والتنمية في الثدييات والشيخوخة ، فضلا عن مساهمتها في التنسيق بين الخلايا والأيض تكاثر الخلايا. ويستند فهمنا من العمليات البيولوجية عن طريق التضمين الميتوكوندريا على أساليب العزل وقوية لمعالجة سليمة الميتوكوندريا من الأنسجة من الحيوانات المختبرية. الميتوكوندريا من قلب فأر واحدة من الأكثر شيوعا في الأعمال التحضيرية للدراسات السابقة والحالية في عملية الأيض الخلوية بما في ذلك دراسات على الحيوانات ، بالضربة القاضية.
نحن هنا وصف مفصل الأسلوب السريع لعزل الميتوكوندريا سليمة مع وجود درجة عالية من اقتران. هذا النوع من التحضير لقلب فأر الميتوكوندريا هو كائن ممتازة للبحوث الفنية والهيكلية على الطاقة الحيوية الخلوية ، ونقل الجزيئات الحيوية ، ودراسات وتحليل البروتين الحمض النووي والبروتينات والدهون.
Protocol
مقدمة
الميتوكوندريا من قلب فأر واحدة من الأكثر شيوعا في الأعمال التحضيرية للدراسات السابقة والحالية في عملية الأيض الخلوية. ويمكن الحصول عليها بسرعة وبشكل موثوق في كمية كبيرة من نوع البرية أو الحيوانات خروج المغلوب. الإجراء عامة تتألف من الأنسجة التي تجزيء عملية الهضم ، والتربسين الطرد المركزي المغاير.
هناك العديد من الشروط التي يجب أن تبقى خلال عزل الميتوكوندريا من الأنسجة المختلفة ، بما في ذلك القلب (الشكل 1).
- نسيج يجب أن يكون المفروم جيدا ، لأنه يؤثر تأثيرا مباشرا على محصول الميتوكوندريا التي حصل عليها. أنسجة القلب من الأفضل أن اللحم المفروم مع مقص منحني الصغيرة ويمكن أن تتبعها استخدام طاحونة Latapie الأنسجة ، أو إذا كان طاحونة الأنسجة غير متوفر ، والصحافة والثوم مع قطر الثقوب مخرج قطرها حوالي 1.0 ملم.
- فمن الضروري للحفاظ على درجة حرارة الحلول في كل خطوة. ولذلك الإجراء بأكمله والتي ستنفذ في غرفة باردة وجميع الصكوك والحلول يجب أن تكون مستعدة وتبريده مقدما. إذا كنت لا يمكن أن أبقى ظروف الحرارة تفقد العديد من الخصائص المستقرة للإعداد. هيكل الميتوكوندريا هي حساسة جدا لتجميد overfreezing ذلك لتعليق (على سبيل المثال أثناء الطرد المركزي) غير مسموح به ، لا سيما إذا دراسات النقل النشط والهام.
- معلمة المهم هو الوقت المناسب للطول الداخلي ؛ يجب أن يتم تنفيذ العزل في أسرع وقت ممكن ، والتحضير لابد من الحصول على استخدامها على الفور. ولذلك ، الأدوات الجراحية ، والحلول والأجهزة يجب أن تكون معدة مسبقا.
المواد والأدوات
الصكوك
- مستقيم مقص التشغيل ، نقطة حادة
- مقص منحني
- ملقط
- طبق بتري
- قمع صغير + قطعة من النايلون تصفية (prewashed)
- 6 أكواب 50 مل
- النمامون اثنين المغناطيسي والحمامات الجليد two
- حمام واحد كبير الجليد
- 2 أشرطة مغناطيسية صغيرة
- ملاعق للتجريف بيليه
- أنابيب الطرد المركزي
- (يمكن استبداله مع الصحافة الثوم) Latapie الصحافة الأنسجة
- تفلون الزجاج homogenisers 20ml و 1 - 2ml
- النفايات الدورق
- إيبندورف أنابيب لتعليق الميتوكوندريا النهائي وعينات لتحديد البروتين
- حمامات الجليد
حلول (محسوبة بنسبة 2 الجرذان) :
- غسل العازلة : 0.3 السكروز M ، HEPES 10 ملم (7.2 درجة الحموضة =) ، و 0.2 ملي EDTA (1000 مل)
- العازلة العزلة : 0.3 السكروز M ، HEPES 10 ملم (الرقم الهيدروجيني = 7.4) ، 0.2 ملي EDTA ، 1 ملغ / مل BSA (سيغما A6003) (100ML أعدت من المخزن المؤقت الغسل). يمكن أن تكون بديلا ألبومين المصل البقري بنسبة أقل تكلفة نظائرها خال من الأحماض الدهنية. ويمكن استخدام نفس المنطقة العازلة أو الاختلافات في متساوي التوتر وإعادة التعليق العازلة.
- التربسين (سيغما T8003) الحل : في 2.5mg/ml 1MM حمض الهيدروكلوريك (0.5 مل)
- مثبط التربسين من فول الصويا (سيغما T9128) 6.5 مل من mg/10 عازلة عزل
بروتوكول
ويظهر المخطط العام للالإجراء على الشكل. 1. يجب أن يبرد القلوب وغسلها في غسالة الأنسجة العازلة البطين ، رفعه ، المفروم ومتجانسة أثناء العلاج الضوئي مع التربسين. يتم طرد تعليق على سرعة منخفضة ويتم طرد وطاف حصلت مرة أخرى في أعلى سرعة لجمع الميتوكوندريا. يمكن بالاعتماد على التجارب المقررة الاستعاضة عن إعادة التعليق العازلة التي متساوي التوتر أي حل آخر.
أنهيت الحيوانات وفقا للالمملكة المتحدة "حيوانات (الإجراءات العلمية) القانون". عنق الرحم عن طريق الخلع تلتها قطع الرأس. فمن الضروري لاستخراج القلب مباشرة بعد قطع الرأس للحيوان ، حتى لا يكون هناك أي تأخير إنهاء بين الحيوانات واستخراج القلب. إذا كان من المتوقع أن العزلة موازية للكبد الميتوكوندريا يكون صام الفئران ليلا قبل التجربة.
- إعداد ثلاثة أكواب تحتوي على 40 مل من الغسل العازلة. تبريدها في حمام الثلج الملح لمدة 3 إلى 5 دقائق قبل الانتقال الى الخطوة التالية. تأكد من عدم overfreeze لهم واستخدامها على الفور بعد السحب من بلورات الثلج تبدأ في الظهور.
- فتح القفص الصدري للفأر مقطوعة الرأس واستخراج القلب. جعل شقوق صغيرة ثم نقل على الفور إلى حل وسط الجليد الباردة في الدورق الأول. تضغط على القلب لإزالة الدم ووضعها في الدورق الثاني. كرر هذه العملية لكل القلب.
- قلوب جافة على ورقة الترشيح. إزالة كل الدهون والدم متخدر ، أذينات فافة وحمام سباحة والنسيج البطين.
- فرم النسيج المجمعة مع مقص منحني صغيرة على طبق بيتري على الجليد لحوالي 5 دقائق حتى حجم الجسيمات حوالي 1-2 ملم.
- وضع الأنسجة المفروم في الصحافة الأنسجة وتمريرمن خلال. أن تدرك أن كمية كبيرة من المواد يمكن أن تبقى في الصحافة حتى جمع جميع أنسجة القلب من أسفل الجدران والصحافة.
- نقل المواد الى الدورق مع 50 مل الاحتياطي الغسل ويحرك. ثم تصفية تعليق من خلال مرشح النايلون. يغسل النسيج مفروم على 3 مرات مع مرشح الاحتياطي الغسل ورفض الترشيح.
- نقل الأنسجة غسلها في 20 مل من الاحتياطي الغسيل ووضعه في حمام الثلج على مغناطيسي. إضافة 0.5 مل من محلول التربسين مع التحريك المستمر وبدء موقت. إعداد آخر مغناطيسي ، حمام الثلج والثاني 50 مل دورق.
- في الدقيقة ال 4 homogenise فترة وجيزة على جزء التعليق من استخدام جزء صغير مجهز بشكل فضفاض الزجاج تفلون homogeniser (10 - 15ml) مع بعدة جلطات صعودا وهبوطا لتفريق بسبب الايقاف. بعد تعليق نقل تجانس في الدورق الثاني. كرر الإجراء في الدقيقة ال 9 ، بحيث يمكنك تنفيذ تجانس لوقف مرتين في المجموع. بعد 15 دقيقة من الحضانة ، إضافة 10 مل من عزل مثبط التربسين العازلة التي تحتوي على واحتضان لمدة 1 دقيقة.
- تصفية التعليق مرة أخرى من خلال مرشح النايلون وحفظ الترشيح. جمع الكسر الجسيمات اليسار على مرشح وhomogenise لمدة 1 دقيقة في 15-20 مل من الاحتياطي الغسل.
- الجمع بين جناسة مع الترشيح والطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 600G.
- تصفية بعناية طاف الناتج إلى أنبوب الطرد المركزي الجديدة. تجنب التلوث من قبل بيليه وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 15 دقيقة في 8500g.
- بعد الطرد المركزي بسرعة عالية وتجاهل طاف شطف 2-3 مرات بيليه مع 1 مل من تجاهل للرقيق الأبيض العازلة طبقة الحافة الخارجية. تفريق بيليه مع ملعقة ولكن تجنب بقعة حمراء من الكريات الحمراء في الأسفل. إذا حصلت على لوس خلايا الدم ، وإزالة البتات الحمراء من التعليق قبل التجانس.
- Resuspend الكرية مع homogeniser صغيرة أو بالتناوب pipetting لطيف. تمييع التعليق مع أكثر Isolationbuffer وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 15 دقيقة في 8500g.
- تجاهل طاف ، resuspend الكرية في إعادة التعليق عازلة (وجود مخزن مؤقت متساوي التوتر في الاختيار) ، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى.
- الناتج البني بيليه يحتوي الميتوكوندريا سليمة غسلها. Resuspend الكرية في حجم صغير جدا من المخزن متساوي التوتر التي تختارها.
الشكل 1. مخطط يدل على خطوة خطوة من إجراءات العزل من قلب فأر الميتوكوندريا. الجزء العلوي ، 1-9 مراحل : تعطيل الأنسجة والعلاج التربسين وتجانس ؛ الجزء السفلي ، ومراحل 10-15 : الطرد المركزي المغاير.
Discussion
يوصف بروتوكول السريع مفصلة لعزل الميتوكوندريا سليمة مع وجود درجة عالية من اقتران. ويمكن استخدام إعداد البحوث الفنية التي تم الحصول عليها لأو الهيكلي على الطاقة الحيوية الخلوية ، والدراسات البروتين أو تحليل الحمض النووي والمحتوى الدهني. ويمكن أيضا للدراسات البيوفيزيائية النقل النشط للأيونات وسيطة الأيضية أن يؤديها. فمن الممكن لعملية إعداد مزيد من الميتوكوندريا من أجل عزل جزيئات submitochondrial ، الغشاء الخارجي أو مكونات منفصلة تنقية الفسفرة المؤكسدة. وصف الأسلوب هو تعديل للبروتوكول قياسي من العزلة التي وجاكوبوس ساكس 1. العائد المتوقع من الميتوكوندريا أعد ما يقرب من 10-15 ملغ من البروتين الميتوكوندريا في القلب والجهاز التنفسي نسبة السيطرة على مالات / الغلوتامات إعداد مثل هذه تختلف ما بين 8 إلى 12 مع تنفس رابعا الدولة نحو 0.12 μmol O البروتين xmin xmg 2 -1 -1 عند 23 درجة مئوية في المتوسط تضم السكروز 0.25 م و 10 ملي بوكل ، EDTA 0.2 ملم ، 5 فوسفات البوتاسيوم ملم (8.0 درجة الحموضة) مع ADP 150 ميكرومتر لبدء التنفس ثالثا الدولة (للظروف الدقيقة والإضافات التجريبية ، انظر المرجع 2).
وينبغي إيلاء اهتمام خاص لالتفاصيل التقنية قبل عدة بدءا من إجراءات العزل. فمن الأهمية بمكان أن الاستخدام النظيف البولي بروبلين أو أنابيب الطرد المركزي ، وبالتالي ينبغي أنابيب غسلها جيدا بفرشاة نظيفة والماء الساخن ، ولكن ينبغي أن تظل معاملة المنظفات في الحد الأدنى. أيضا ، فمن الأفضل لجمع كل الأواني والأدوات اللازمة في الغرفة الباردة قبل يوم من العزلة.
خلال العزلة عندما نقل إلى مخازن قوارير من الأكواب ، ينبغي إيلاء اهتمام خاص а لمنع قطرات من الماء المثلج في الحلول. يجب عند التعامل مع الأنسجة ينبغي التشديد على أنه ينبغي أن يتم استخراج القلب في أقرب وقت ممكن حتى منذ فترة قصيرة من التأخير بين انفصال رأس الحيوان وتبريد الأنسجة من شأنه أن يؤدي في الميتوكوندريا uncoupled جزئيا. التبريد السريع والغسل الكامل للقلوب إزالة أمر ضروري للحصول على إعداد المعيار ، وخالية من خضاب الدم وكرات الدم الحمراء NADase.
يستخدم التربسين عن تدهور البروتينات الضام لزيادة حساسية الأنسجة للقوة القص خلال التجانس. وينبغي تجنب التعرض لفترة طويلة من النسيج البروتيني لأنها نتيجة في الميتوكوندريا من نوعية رديئة.
وينبغي بعد centrifugations عالية السرعة أن تمحى من على الجدران أنابيب الطرد المركزي مع المناديل الورقية لإزالة أي رواسب من المواد الدهون المتراكمة على الجدران.
لإعادة تعليق النهائي فإنه من الأفضل استخدام حجم منخفض من المنطقة العازلة النهائية من أجل تقليل الخسائر في الوظائف الميتوكوندريا أثناء التخزين (150 الى 200 ميكرولتر من المنطقة العازلة في القلب). لإجراء دراسات حول نقل الكاتيونات ثنائي التكافؤ يجب أن أية عوامل مخلبية تكون موجودة في الميتوكوندريا الإعداد النهائي وبالتالي يجب غسلها عدة مرات مع EGTA خالية المتوسطة واستخدامها في غضون ساعات الأولى بعد العزلة.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر الأستاذ الدكتور أ. فينوجرادوف وGrivennikova فيرا لإدخال الكتاب في ميدان البيولوجيا الميتوكوندريا ورؤى كثيرة مفيدة والمشورة في هذا الإجراء. المؤلفون ممتنون السيدة أماندا McKintock من مكتب جامعة كوينز وسائل الإعلام للمساعدة في إعداد الفيديو.
References
- Jacobus, W. E., Saks, V. A. Creatine kinase of heart mitochondria: changes in its kinetic properties induced by coupling to oxidative phosphorylation. Arch. Biochem. Biophys. 219, 167-178 (1982).
- Gostimskaya, I. S., Grivennikova, V. G., Zharova, T. V., Bakeeva, L. E., Vinogradov, A. D. In situ assay of the intramitochondrial enzymes: use of alamethicin for permeabilization of mitochondria. Anal. Biochem. 313, 46-52 (2003).
