Summary
Протоколы описать основные шаги для получения дифракционных качество кристаллов мембранный белок, начиная от воссоздания белков в липидный кубической фазы (КСУ), найти начальные условия с LCP-FRAP предварительной кристаллизации анализов, создание LCP испытаний кристаллизации и уборки кристаллов .
Abstract
Мембранные белки выполняют важные функции в живых клетках, связанных с передачи сигнала, транспортных и энергетических преобразований, и, как таковая, вовлечены в множество сбоев и заболеваний. Тем не менее, структурные и функциональные пониманию мембранных белков сильно отстает от своих партнеров растворимым, главным образом, из-за трудностей, связанных с их растворения и образования кристаллов дифракционных качества. Кристаллизация в липидных мезофаз (также известный как при кристаллизации мезо или ЛКП) является перспективной техники, которая была успешно применена для получения высоких структур разрешение микробных rhodopsins, фотосинтетических белков, внешний баррелей бета-мембраны и G-белком рецепторы. В мезо кристаллизации использует родной подобные мембраны окружающей среды и обычно производит кристаллы с более низким содержанием растворителя и лучше заказов по сравнению с традиционными кристаллизации из моющих растворов. Метод не сложно, но требует понимания липидного поведение фазы и практики в обработке вязких материалов мезофазы. Здесь мы показываем, простой и эффективный способ сделать LCP и восстановлении мембранных белков в липидный бислой LCP при помощи шприца смеситель, затем выдачи nanoliter части LCP в анализе или кристаллизации пластины, проведении предварительной кристаллизации анализов и сбора урожая кристаллов из Матрица LCP. Эти протоколы обеспечивают базовое руководство для приближения в испытаниях мезо кристаллизации, однако, как и любой эксперимент кристаллизации, обширные проверки и оптимизации требуется, и успех не всегда гарантирован.
Protocol
Типичный контур в эксперименте кристаллизации мезо показано на рис.1 1,2. Предварительно кристаллизации LCP-FRAP анализы не являются обязательными, однако, они могут значительно ускорить процесс поиска начальных условий кристаллизации, особенно в случае сложных белков мембраны 3.
1. Белки Восстановление в КСУ
- Purify мембранного белка интереса к моющим раствором и сосредоточиться белка / моющего средства комплексов до ~ 10 - 20 мг / мл, заботясь, чтобы не за-концентрат 1,4 моющего средства.
- Передача ~ 25 мг LCP липидного хоста (как правило, моноолеина) или липидные смеси в 1,5 мл пластиковая трубка и инкубировать при температуре 40 ° С в течение нескольких минут, пока липидного расплавов.
- Прикрепите шприц переходник для 100 мкл газонепроницаемый шприц.
- Нагрузка шприц с расплавленным липидного использованием регулируемой пипетки объемом. Запись объема липидов в шприц.
- Нагрузка еще 100 мкл шприц раствор белка в растворе белка-на-липидный соотношение 2 / 3 В / В.
- Подключите оба шприцы вместе через шприц муфты.
- Нажмите шприц плунжеров попеременно двигаться липидов и белков через внутреннюю иглу ответвитель, назад и вперед, пока липидного мезофазы становится однородным. LCP формы спонтанно после механического перемешивания, а белок становится воссоздана в липидный бислой LCP. Формирование КСУ может быть проверена путем ее прозрачной и гелеобразной консистенции и из-за отсутствия birefringency, если смотреть под микроскопом оснащен кросс-поляризаторы, или, если возможно, с помощью малоуглового рентгеновского дифракционного 1.
2. LCP-FRAP предварительной кристаллизации Анализы
LCP-FRAP тесты предназначены для измерения свойств диффузии мембранных белков воссоздана в КСУ в различных условиях скрининга 3. Дальний диффузии мембранных белков в КСУ имеет важное значение для успешной кристаллизации, однако, микроструктуры LCP ограничивает диффузию больших белков или олигомерных агрегатов белка. Распространенная причина провала в эксперименте кристаллизации мезо это быстрый агрегации белков приводит к потере диффузии. Было показано, что агрегация поведение белка зависит от конкретного построить белка, липидов и хост состав скрининга решение 3.
- Этикетка белок с флуоресцентным красителем (Cy3 или подобный) на белок / краска отношение ~ 100 / 1, удаления непрореагировавшего красителя и концентрат белка до ~ 1 мг / мл. Этикетка либо бесплатно, амины или бесплатно тиолов. При маркировке свободных аминов, использование рН между 7 и 7,5 до преимущественно этикетке свободных N-конца. Помните, что аминокислоты маркировки может также этикетки липидов совместно с очищенным белком 2,3.
- Развести меченых белков в КСУ, как описано в разделе 1).
- Настройка анализа пластин, как описано в разделе 3), используя LCP-FRAP решения скрининга вместо кристаллизации экраны 2.
- Инкубируйте пластин при 20 ° С в темноте в течение не менее 12 часов для достижения равновесного состояния.
- Разместите один из пластин на LCP-FRAP станции и сосредоточиться на первой скважины использовании 10x цели.
- Приобретать 5 флуоресцентные изображения для захвата начальной предварительно просветленного состояния.
- Триггер лазера. Мощность лазера и количество импульсов должна быть скорректирована, чтобы отбелить ~ 30 - 70% меченого белка в середине беленой месте.
- Сразу же после запуска лазера, начать запись быстро после отбеливания последовательность ~ 200 изображений в максимально возможной скоростью.
- Следуйте с записью медленный после отбеливания последовательность ~ 50 изображений, выбор задержки между снимками, как 1-20 с, в зависимости от скорости диффузии белка.
- Интеграция интенсивности внутри отбеливателя место во всех кадрах и исправить ее для отбеливания и световую интенсивность колебаний при приобретении путем деления интенсивности внутри беленой пятно усредненная интенсивность ссылкой месте за пределами лазерной беленой области.
- Нормализация исправлены интенсивности, чтобы предварительно отбеленной интенсивности равны 1, а начальная беленой интенсивность равна 0.
- Fit кривой нормированной интенсивности в зависимости от времени, F (т), по следующей формуле 5:
F (т) = М х ехр (-2Т / т) х (я 0 (2Т / т) + I 1 (2Т / т)), (Eq.1)
где М мобильных долю диффундирующих молекул, T-характерное время диффузии, т есть реальное время каждого записанного кадра, I 0 и I 1 в 0-й и 1-го порядка модифицированные функции Бесселя. - Вычислить коэффициент диффузии, D, как:
D = R 2 / 4Т (Eq.2)
где R-радиус беленой месте. - Перемещение то следующем хорошо и повторите шаги 2,5) - 2.13).
- Сравнить мобильный фракций и коэффициентов диффузии, полученные для различных условий отбора. Дизайн новой кристаллизации экранов на основе компонентов, которые облегченной диффузии белка и без учета условий, при которых белок диффузии не наблюдалось. Если белка не диффундируют в любом из экранированных условиях, рассмотреть вопрос о расширении пространства скрининга или пытаются построить новый белок.
3. Настройка LCP Испытания Кристаллизация
- Развести белка в КСУ, как описано в разделе 1).
- Передача белка нагруженные LCP в 10 мкл газонепроницаемый шприц прилагается к повторяющимся диспенсер шприц.
- Прикрепите короткое съемной иглой (калибр 26, 10 мм длина) до 10 мкл шприц.
- Внесите 200 нл болюсов LCP на поверхности четырех соседних скважин формирования квадрат 2х2.
- Наложение каждого из болюсов КСУ с 1 мкл соответствующего решения экране кристаллизации.
- Cap четыре загружены скважин с 18 мм квадратных покровного стекла. Применить мягкое давление на покровное для герметизации скважин.
- Повторите шаги 3.4) -3,6) со следующим набором 4 скважины, пока вся пластинка будет заполнен.
- Инкубируйте планшет при постоянной температуре, периодически проверяя образования кристаллов и роста.
4. Сбор кристаллов из LCP
- Место пластина с кристаллами белка под стерео микроскоп с переменным увеличением, оснащен линейными вращающимся поляризатором и анализатором.
- В центре внимания также интерес использование низких трансфокации так что все хорошо помещается в поле зрения.
- Оценка покровного стекла в четыре удара решения квадратных внутри и границы использования острый угол керамического капиллярного резки камня.
- Пресс всему периметру забил с сильным острым пинцетом точки для распространения через царапины толщина покровного стекла.
- Удар два маленьких отверстия на противоположных углах квадрата забил.
- Inject несколько мкл осадителя раствора через одно из отверстий, чтобы уменьшить обезвоживание во время последующих шагов.
- Использование угловой резкое зонда иглы разбить стекло вдоль одной или двух сторон, чтобы освободить выреза площади.
- Аккуратно поднимите смотреть стекло квадрат для кубических болюсного фазу. Если болюсного прилипла к покровным, затем переверните стекло квадрат снова и место на дне колодца.
- Добавить дополнительные несколько мкл осадителя решения, дополненные крио-защитное, в случае необходимости, на вершине подвергается кубических болюсного фазы в скважине.
- Увеличение увеличением микроскопа и сосредоточиться на кристалле.
- Отрегулируйте угол между поляризатором и анализатором, чтобы увеличить контраст между двулучепреломляющих кристалла и фона, сохраняя при этом достаточно света, чтобы увидеть уборки петли.
- Выберите MiTeGen MicroMount с диаметром соответствующий размер кристалла, а затем урожай кристалла непосредственно из КСУ по черпая ее в MicroMount.
- Flash Freeze MicroMount с собрано кристалла в жидком азоте, и отправить ее в beamline синхротронного источника рентгеновского сбора данных 6.
5. Представитель Результаты:
Инженерии человека бета-2 адренергические G-белком рецептор (β 2-АР T4L) была высказана в бакуловирусной инфицированных Sf9 клетках насекомых и очищенный в dodecylmaltoside (DDM) / гемисукцинат холестерина (ХС) раствором моющего средства связаны с частичным обратным агонистом carazolol 7. Белка была помечена Cy3 эфир NHS и используются в LCP-FRAP предварительной кристаллизации анализы (рис. 2). Грубые экранов сетка основана на нескольких условиях, выбранных по результатам LCP-FRAP анализы производятся начальные кристаллические хитов (рис. 3). Дальнейшая оптимизация осадителя условия дали дифракции качество кристаллов (рис. 4).
Рисунок 1. Блок-схема типичного эксперимента кристаллизации LCP. Шаги в серые коробки, не описанных в текущих протоколов.
Рисунок 2. LCP-FRAP пробы с β 2 AR-T4L/carazolol в моноолеина основан LCP. ) Результаты LCP-FRAP анализ выполняется в автоматическом высокой пропускной режим, в котором каждый образец 96-луночного планшета отбеливается последовательно и флуоресценции восстановления измеряется после 30 мин инкубации. Получить флуоресценцию возмещений, которые представляют собой мобильные долю в каждом образце, построены для всех 96 образцов. Скрининга растворы содержат 0,1 М Трис рН 8, 30% об. / ПЭГ 400 в сочетании с 48 различных солей в двух различных концентрациях. Б) восстановления флуоресценции профилей для нескольких репутацияставителем условиях. Сплошные кривые линии представляют подходит уравнением. 1.The мобильных фракций и коэффициентов диффузии определяются по формулам. 1 и 2. Быстрое восстановление менее 10% в образце, содержащем хлорид натрия связано с флуоресцентно меченных липидов совместно с очищенным белком.
Рисунок 3. Первоначальные хитов кристалла β 2 AR-T4L/carazolol получен грубый отбор сетку вокруг наиболее перспективные условия, определенные LCP-FRAP, содержащих Na сульфат (панели) и Na Формиат (группа В). Белок помечены Cy3 эфир NHS и флуоресцентные изображения, сделанные с использованием возбуждения при 543 нм и эмиссии при 605 нм.
Рисунок 4. Оптимизированная кристаллы β 2 AR-T4L/carazolol. Изображения кристаллов, выращенных в присутствии сульфата натрия (панели и В) и К Формиат (панели C и D) берутся в режиме светлого (панели и С) и с помощью кросс-поляризаторов (панелей B и D).
Discussion
Протоколы обеспечивают основные визуальные руководства для основных этапов выполнения в экспериментах мезо кристаллизации. Более углубленное детали, связанные с этими протоколами, подчеркнув, возможных подводных камнях, недостатки или альтернативные маршруты имеются в других местах 1,2. Дополнительный LCP-FRAP анализы могут помочь на более ранних стадиях, чтобы выбрать наиболее перспективные белка построить, LCP липидного хоста и липидного добавок, а также ограничить диапазон возможных осадителей и буферных условиях 3. Как только первоначальный удар кристаллизации найден, он должен быть оптимизирован для получения лучшего качества кристаллов. Оптимизация в условиях мезо кристаллизации по сути похожа на оптимизацию условий для растворимых белков с добавлением дополнительных параметров, связанных с составом КСУ 1. Мембранные белки кристаллов, выращенных в липидных мезофазы, как правило, меньше по размеру, чем кристаллы, полученные в растворе моющего средства, но более упорядоченной, таким образом, извлечение преимуществ от использования сильно микрофокусной beamlines доступны в современных источниках синхротронного 6.
Многие из процедур, связанных с в мезо кристаллизации, в том числе создание кристаллизации или анализа пластины, проведении LCP-FRAP анализов и выявления кристаллов, были полу-или полностью автоматизированной 1,2,8,9, позволяя скрининга большого диапазона условий но при этом потребляет небольшое количество белков и липидов. С другой стороны, белок reconstitutions в КСУ и кристально уборки остаются ручные и более утомительным операций и, таким образом, есть потребность в улучшении.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась в частях NIH гранты GM073197 и RR025336.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μL gas-tight syringe | Hamilton Co | 7656-01 | 2 syringes are required |
| 10 μL gas-tight syringe | Hamilton Co | 7653-01 | |
| Syringe coupler | Hamilton Co | 7770-02 30902 | The coupler can be made using available parts as described in refs. 10 |
| Repetitive syringe dispenser | Hamilton Co | 83700 | The repetitive syringe dispenser can be modified to reduce dispensing volume by ~3 times11 |
| Short (0.375”) flat-tipped removable needle (point style 3, gauge 26) | Hamilton Co | 7804-03 | |
| 96-well glass sandwich plate | Marienfeld | 08 900 03 | For manual operations it is more convenient to assemble the glass sandwich plate using a standard microscope glass slides and a double sticky tape with punched holes1,2,12. |
| Glass cover slip | Electron Microscopy Sciences | 63787-01 | |
| monoolein | Sigma-Aldrich | M7765 | |
| Crystallization screens | Hampton Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience | Most of available commercial screens can be used for initial screening. Conditions that consistently disrupt LCP can be diluted 2x for better compatibility13. | |
| Capillary cutting stone | Hampton Research | HR4-334 | |
| Fine point tweezers | Ted Pella, Inc. | 510 | |
| Angled sharp probe | Ted Pella, Inc. | 13650 | |
| MicroMounts | MiTeGen | M1-Lxx-xx | Select MicroMount diameter to match the crystal size |
References
- Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).
- Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets. Methods Mol. Biol. 654, 141-170 (2010).
- Cherezov, V., Liu, J., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Stevens, R. C. LCP-FRAP assay for pre-screening membrane proteins for in meso crystallization. J. Cryst. Growth Design. 8, 4307-4315 (2008).
- Misquitta, Y., Caffrey, M. Detergents destabilize the cubic phase of monoolein: implications for membrane protein crystallization. Biophys. J. 79, 394-405 (2003).
- Soumpasis, D. M. Theoretical analysis of fluorescence photobleaching recovery experiments. Biophys. J. 41, 95-97 (1983).
- Cherezov, V., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Hilgart, M. C., Sanishvili, R., Nagarajan, V., Stepanov, S., Fischetti, R. F., Kuhn, P., Stevens, R. C. Rastering strategy for screening and centering of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 micrometer size X-ray synchrotron beam. J. R. Soc. Interface. 6, S587-S597 (2009).
- Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Stevens, R. C. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases. Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).
- Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases. Anal. Chem. 82, 491-497 (2010).
- Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).
- Cherezov, V., Caffrey, M. A simple and inexpensive nanoliter-volume dispenser for highly viscous materials used in membrane protein crystallization. J. Appl. Cryst. 38, 398-400 (2005).
- Cherezov, V., Caffrey, M. Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins. J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).
- Cherezov, V., Fersi, H., Caffrey, M. Crystallization screens: compatibility with the lipidic cubic phase for in meso crystallization of membrane proteins. Biophys J. 81, 225-242 (2001).
