Генерация индуцированного регуляторных Т клеток из первичной человека наивного и Т-клеток памяти

Summary

Мы опишем метод для создания нормативной, оперативной памяти и наивных Т-клеток из одной человеческой донорской крови. Поляризованный Tregs можно затем по сравнению с другими подмножества в различных генетических и функциональных приложений с генетической однородности, в том числе подавление анализ также подробно здесь.

Abstract

Разработка и сопровождение иммуносупрессивных CD4 ⁺ регуляторных Т-клеток (Tregs) способствуют периферической толерантности необходимо оставаться в иммунологический гомеостаз с огромным количеством себе и комменсальных антигенов и на организм человека. Возмущения в балансе между Tregs и воспалительных обычные Т-клеток может привести к иммунопатологии или рак. Хотя терапевтические инъекции Tregs было показано, что эффективность в мышиных моделях колита ^1, тип диабета ^2, ревматоидный артрит и трансплантат против хозяина, ⁴ несколько принципиальных отличий в сравнении с человеческой мыши Treg биологии ^5, до сих пор препятствует клинического использования. Отсутствие достаточного количества, чистоты, стабильности и наведения специфику терапевтической Tregs необходимость динамическая платформа развития человека Treg, на котором для оптимизации условий для расширения своих бывших естественных ^6.

Здесь уровня Дописывать круг метод дифференциации индуцированных Tregs (iTregs) из одной человеческой периферической крови доноров, которые могут быть разбиты на четыре этапа: изоляция мононуклеарных клеток периферической крови, магнитные выбор CD4 ⁺ Т-клетки, в пробирке культуру клеток и флуоресцентных активированный сортировки клеток (FACS) Т подмножеств клеток. С Treg подпись транскрипционный фактор forkhead окно P3 (FOXP3) является активация вызванных фактором транскрипции у людей ⁷ и никакой другой уникальный маркер существует, комбинаторной панели маркеров должны быть использованы для определения Т-лимфоцитов с супрессорной активности. После шести дней в культуре клетки в нашей системе может быть разграничены на наивных Т-клеток, Т-клетки памяти или iTregs на основе их относительной выражение CD25 и CD45RA. В ячейках памяти и наивных Т имеют различные сообщил поляризации требования и пластичности ⁸ предварительной сортировки исходной популяции Т-клеток в CD45RA ^{+ +} и CD45RO подмножества может бE используется для изучения этих расхождений. В соответствии с другим, наши CD25 ^Привет CD45RA ^- iTregs экспресс высокого уровня FOXP3 ⁹ GITR и CTLA-4 ¹¹ и низкого уровня CD127 ^12. После FACS каждой популяции, полученные в результате клетки могут быть использованы в анализе супрессоров, которая оценивает относительную способность замедлить распространение карбоксифлуоресцеина сукцинимидил эфира (CFSE)-меченных аутологичных Т-клеток.

Protocol

1. Выделение человека мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК) из шерсти Баффи

1. Приобретает одну единицу слой кровяного сгустка из больницы или поблизости от расположения центра крови. Наш центр крови дает нам около 40-60 мл лейкомассы на единицу получил от нормальных доноров крови.
2. Налейте крови в автоклаве 500 мл стеклянный флакон, содержащий стерильный PBS разбавить лейкомассы. Окончательный объем PBS + лейкомассы должно быть 250 мл.
3. Заполнить десять 50 мл конические пробирки по 20 мл Lymphoprep решение.
4. Аккуратно наложить Lymphoprep решение с 25 мл разбавленного слоя кровяного сгустка, стараясь не нарушить Lymphoprep решение.
5. Спиновая трубы в течение 30 минут при комнатной температуре в 500 х гр. Убедитесь в том, чтобы выключить тормоза центрифуги, чтобы не мешать лимфоцитов фракции.
6. Соберите МНПК на границе Lymphoprep и плазмы средних слоев с пипеткой. Аспирируйте плазмы от средней до около 1 млпо-прежнему покрывает слой лейкомассы содержащие МНПК. С помощью 10 мл пипетки перенести МНПК на новый 50 мл трубку.
7. Промойте клетки дважды PBS и ресуспендируют клеток в 50 мл холодной RPMI рассчитывать на гемоцитометра. Типичные восстановления составляет 8 × 10 ⁸ - 1 х 10 ⁹ МНПК.

Эта процедура может быть уменьшено для небольших объемов крови. Разведение образцов цельной крови составляет 1:1 в PBS.

2. Магнитные негативной селекции Всего CD4 ⁺ Т-клеток CD4 ^{+ +} CD45RA наивные Т-клеток CD4 ⁺ или CD45RO ⁺ Т-клеток памяти с использованием МНПК EasySep комплекты обогащения (стволовых клеточных технологий)

Последовательность действий для 1 х 10 ⁸ до 4,25 х 10 ⁸ МНПК.

1. Ресуспендируйте МНПК до конечной концентрации 5 × 10 ^{7 процентов} мл в PBS, содержащем 2% FBS и 1 мМ ЭДТА. Перемещение клеток к новому 14 мл полипропиленовые круглой трубе вниз.
   Изоляция от общего числа человеческих CD4 ⁺ T-клеток негативный отбор: добавить человека CD4 ⁺ Т-клеток Обогащение коктейль антител (50 мкл на мл МНПК), перемешать и инкубировать 10 минут при комнатной температуре.
   1. Выделение человека наивных Т-клеток путем отрицательного отбора: добавить 50 мкл анти-CD45RO антитела на мл клеточной суспензии МКПК, перемешать и инкубировать 15 минут при комнатной температуре. Добавить обогащения коктейль поставляемые в наборе (50 мкл на мл МНПК), перемешайте и выдержите при комнатной температуре в течение 10 минут.
   2. Выделение человека Т-клеток памяти негативный отбор: добавить памяти человека CD4 ⁺ Т-клеток Обогащение коктейль антител (50 мкл на мл МНПК), перемешать и инкубировать 10 минут при комнатной температуре.
2. Смешайте магнитных частиц и в равной степени распределить их по всему решению. Не вихрь наночастиц из наивных комплект.
3. Добавить магнитных частиц (100 мкл на мл МНПК для общего CD4 ⁺ T и наивно выбора ячейки, 50 мкл на мл МНПК для выбора ячейки памяти T). Микс, мягко пипетки 2-3 раза и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут для наивных Т выбора ячейки или 5 минут на память или полное CD4 ⁺ Т-клеточной селекции.
4. Добавить PBS, содержащий 2% FBS и 1 мМ ЭДТА, чтобы довести объем до 10 мл на трубе. Смешать, осторожно пипеткой 2-3 раза прежде, чем поместить трубку в раскрытый серебряный магнит EasySep на 5, 10 или 2,5 минут для полной CD4 ⁺ Т-клеток, наивные и память подмножества соответственно.
5. В трубке по-прежнему в магнит EasySep, залить жидкость в новой 50 мл трубку, чтобы изолировать клетки интерес.
6. Повторите шаги 2.5 и 2.6 для лучшего восстановления.

3. Условия культуры клеток, чтобы вызвать регуляторных Т клеток

1. За день до шаги 1 и 2, пальто пластин культуры тканей, сначала разбавляя анти-CD3 антитела (OKT3 клон) в концентрации 1 мкг / мл в стерильном PBS. Для 6-луночного планшета добавляют 2 мл PBS + анти-CD3 на лунку, для 12-луночного планшета добавляют 1 мл или 24-луночного планшета добавить 500 мкл на лунку. Держите покрытие пластин при температуре 4 ° C до использования.
2. Подготовить поляризация среды добавлением 10% тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 50 мкМ β-меркаптоэтанол в RPMI-1640 предварительно дополнить 2,06 мм Glutamax-я и 25 мМ HEPES буфера. Затем добавьте 2 нг / мл TGF-β и 5 нг / мл IL-2. Здесь можно добавить лигандами или ингибиторов, представляющих интерес для СМИ. Ресуспендируйте клетки на шаге 2 в концентрации 2 х 10 ⁶ клеток / мл поляризации среды.
3. Предварительно теплой пластин при 37 ° С и аспирации PBS из анти-CD3-лунок перед добавлением клеток. Добавить 4 мл на лунку клеточной суспензии для 6 лунками, 2 мл клеток для 12-луночного планшета или 1 мл клеток для 24-луночного планшета. Заполнение пустых скважин с PBS, чтобы уменьшить испарениесредства массовой информации. Выдержите в течение 3 дней при температуре 37 ° C / 5% CO _2.
4. На 3-й день после покрытия, замедления вращения пластин в центрифуге в течение 5 минут при 500 х гр. Не нарушая Т-клеток в нижней части плиты, удалите половину средств массовой информации и заменить свежей информации. Кроме того, если и становится переполнен клеток (концентрация выше 3 х 10 ⁶ / мл), разделите объем в равной степени в другой анти-CD3 покрытием плиты и добавить свежие СМИ обратно до первоначального объема. Выдержите в течение двух-трех дней при температуре 37 ° C / 5% CO _2.

4. Флуоресценции, активированных сортировки клеток (FACS) трех популяций Т-клеток

1. Подготовить FACS моющий буфер добавлением 0,5% (вес / объем) бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 2 мМ ЭДТА в стерильной PBS. Место буфера при 4 ° С для получения холода.
2. Удалить из клеток и клеточных культур и промойте каждую лунку с 2 мл PBS, чтобы обеспечить полное восстановление клеток. Поместите все клетки в 50 мл труб полипропиленовых и центрифуги в 500 мкг в течение 10минут при 4 ° C.
3. Подсчитать ячейки гемоцитометра, чтобы определить плотность клеток.
4. Место 3-5 х 10 ⁵ клеток на трубе в четыре отдельные 5 мл круглым дном полистирола трубы для компенсации управления. Положите оставшиеся клетки в 50 мл полипропиленовые трубы, не более 35 х 10 ⁶ клеток на трубе.
5. Спином вниз клетки в течение 5 минут при температуре 4 ° C и аспирации СМИ. Ресуспендируйте клетки должны быть отсортированы в 90 мкл холодного промывочного буфера в 1 х 10 ⁶ клеток. Ресуспендируйте в 100 мкл холодного буфера стиральные трубы компенсации управления.
6. Для ячейки, которые будут отсортированы, объединить 2 мкл анти-CD25-PE, 3 мкл против CD45RA-PE-Cy5 и 1 мкл анти-CD127 АПК на 1 х 10 ⁶ клеток. Добавить нет антител к первой трубе контроль компенсации, 2 мкл анти-CD25-PE на второй трубе, 3 мкл против CD45RA ^- PE-Cy5 третьей трубы and1 мкл анти-CD127 АПК в четвертом трубку. Выдержите все трубы на льду в течение 45 минут в темноте.
7. Аспирируйте буфера и ресуспендирования клеток в концентрации 1 х 10 ⁷ клеток на мл промывочного буфера. Добавить 1,5 мкл ДНКазы II на мл клеток до фильтрации через сито 40 мкМ клетки нейлона. Перемещение клеток в нескольких 5 мл труб круглого сечения нижней полипропилена с не более 3,5 мл на трубе. Ресуспендируйте клеток компенсации контроля в 300 мкл промывочного буфера.
8. Установите компенсацию на проточный цитометр MoFlo минимизировать крест обнаружения PE, APC и PE-Cy5 фильтров. Установить ворота сортировать iTregs (CD25 CD127 ^{Привет -/LOW} CD45RA ^- клетки), наивно (CD25 ^+-CD45RA) и памяти (CD25 ^- CD45RA ^-) Т-клеток в 5 мл круглым дном полистирола пробирки 1 мл новорожденных телячьей сыворотки.

5. Анализ борьбе

1. Сделать suppression анализа СМИ, добавив 100 ЕД / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 5 нг / мл IL-2 и 2 нг / мл TGF-β в AIM-V.
2. В день теста, очистить гетерологичных CD4 ⁺ Т-клеток из лейкомассы, как указано в пунктах 1 и 2. Это будут клетки-мишени для подавления анализа и не содержат CD25 ⁺ клеток Treg, как видно на рисунке 2, 0-й день.
3. Этикетка клеток CellTrace комплект в соответствии с инструкциями производителя, за исключением использования только 1 мкл 5 мМ маточного раствора в мл клеток вместо 2 мкл. Сохранение из прямого света, добавьте 18 мкл ДМСО поставляется комплект CellTrace в один флакон CFSE сделать 5 мМ маточного раствора. Ресуспендируйте необходимое количество клеток-мишеней (не более 1 х 10 ⁷⁾ в подогретую PBS + 0,1% (вес / объем) BSA до конечной концентрации 1 х 10 ⁶ клеток / мл. Добавить 1 мкл 5 мМ CFSE на мл клеток и инкубировать при 37 ° С на водяной бане в течение 5 Minutх годов. Добавить 5 томов полного, ледяной RPMI с 10% FBS, чтобы утолить окрашивания и инкубировать на льду в течение 5 минут. Промойте клетки в два раза больше холодной полной RPMI и ресуспендируют 1 х 10 ⁵ клеток в 100 мкл среды подавление анализа.
4. TREG бисером подавление инспектора находятся на складе концентрации 2 х 10 ⁷ бусин / мл. Гранул количество шариков равно общему числу клеток в эксперименте быстро центрифугирования в пробирке Эппендорф. Вымойте бисером раз с RPMI и вновь гранул. После того, как стремление RPMI, Ресуспендируйте бусины так, чтобы соответствующее количество бусин в хорошо находится в 8 мкл СМИ подавление анализа.
5. Для 96 с круглым дном пластины культуре ткани, добавить CFSE-окрашенных клеток (1 х 10 ⁵ клеток / мл), инспектор бисера и поляризованное и сортируют клетки (1 х 10 ⁵ клеток / мл) в свежем анализе подавление средств массовой информации к желаемой цели (CFSE окрашенных) эффекторные (отсортированы) соотношение в конечном объеме 200 мкл. Все условия, которые установлены в tripliКейтс.
6. Подготовка первого из двух условий контроль, добавляя по 100 мкл клеток CFSE окрашенные, 8 мкл инспектор бусы и 1 х 10 ⁵ свежих, неокрашенных клеток в 92 мкл супрессоров среднего анализ на лунку. Подготовка второй элемент управления с тем же клеточных компонентов, как указано выше, но без TREG инспектор бисера.
7. Крышка в алюминиевую фольгу и инкубировать при температуре 37 ° C / 5% CO ₂ в течение пяти дней.
8. В темноте, сбора клеток из каждой лунки с помощью пипетки и место в 5 мл полистирола круглой трубе вниз. Центрифуга клеток при 500 мкг в течение 5 минут при температуре 4 ° C, аспирации средствах массовой информации, и ресуспендируют в 300 мкл холодного FACS промывочного буфера, начиная с шага 4. Анализ первых 3-х 10 ^{4 +} CFSE события из живых лимфоцитов ворота представляющие клетки-мишени в виде гистограммы с сотового программное обеспечение Quest.

6. Представитель Результаты

Пример проточной цитометрии псевдо разбросанных участков в течение пяти дней временной связьюРГП разграничение iTreg мониторинга на основе относительной коэкспрессией CD25 с FOXP3, CTLA-4 и CD45RA можно увидеть на рисунке 2. Гистограмма на рисунке 3 показан успешный тест подавления, в котором сортируются iTregs (CD25 ^Привет CD45RA ^- CD127 ^-/LOW клеток). Являются только подмножество из пятидневной культура, которая приобрела регулирования / подавитель способность Рисунок 4 показывает индукция Tregs от наивных Т-клеток бассейн (верхняя панель) и ячейки памяти T бассейн (нижняя панель), по истечении пяти дней культуры в стандартной среде iTreg. CFSE окрашивания исходных клеток показали, что либо наивные (вверху справа) или Т-клетки памяти (внизу справа) дифференцироваться в iTregs (высшая FOXP3-экспрессирующие клетки) только после нескольких раундов деления клеток.

Рисунок 1. Схема экспериментальной процедуры. МНПК арэлектронной выделяется из периферической крови человека с помощью центрифугирования в градиенте магнитного до отрицательного отбора CD4 ⁺ CD25 ^- Т-клеток. Через пять-шесть дней в области культуры, клетки подвергаются FACS и совместно инкубируют с гетерологичной CFSE меченых клеток-мишеней для измерения активности супрессоров.

Рисунок 2 очищенная человека первичных CD4 ⁺ CD25 ^-. Т-клетки культивировали в iTreg среды. Аликвоту клеток собраны только после изоляции (день 0) и на 1, 3 и 5 клеточных культур для контроля за ходом CD45RA, FOXP3, CTLA-4 и CD25 маркеров. ITreg профиль соответствует CD45RA ^-, FOXP3 ^{Привет,} CTLA-4 и CD25 ^{Привет Привет} (выделены в окне графика).

Рисунок 3. Очищенная CD4 ⁺ CFSE лаБелед клетки (1 х 10 ⁵ / а) культивируют с TREG бисером подавление инспектор в присутствии отсортированы наивным, памяти или iTreg клеток (3 х 10 ⁴ / а). Через пять дней, клетки собирают и CFSE профиль окрашенных клеток анализировали с помощью проточной цитометрии. Наличие iTreg клетки полностью отменяет распространение CD4 ⁺ Т-клеток. Цифры свидетельствуют о процентах CFSE-меченых клеток, которые прошли подразделения.

Рисунок 4 очищенные человеческие первичной наивно. (CD4 ⁺ CD25 ^- CD45RA ⁺⁾ и памяти (CD4 ⁺ CD25 ^- CD45RO ⁺⁾ Т-клетки окрашиваются CFSE и культурной iTreg в среду. Через пять дней клетки phenotyped и скорость деления клеток оценивается. Как показано на рисунке 2, iTreg подмножество отличается от обоих подмножества соответствуетCD45RA ^- CD25 ^{Привет Привет} FOXP3 и CTLA-4 ^Привет (два последних не показано). Сравнительный профиль окрашивания CFSE определить iTregs (здесь как высшая выражения FOXP3 Т-клетки), как наиболее пролиферативные клетки в течение пяти дней культуры.

Discussion

Хотя Treg передачи держит огромный терапевтический обещание в борьбе с аутоиммунными отторжения трансплантата и других иммунных или воспалительных опосредованного нарушения, методы их эффективного формирования и стабильного обслуживания до сих пор не разработаны. Как только 1-5% циркулирующих человеческих клеток Т Tregs, их контролируемое расширение и дифференциация преодолевает эту нехватку, как основным сдерживающим фактором реализации Tregs в клинику. С другой стороны, как мы узнали из TGN1412 суда ^13, это научно и этически необходимо глубокое понимание молекулярных событий, которые оркестрируют человека Т-клеток, судьба решений до реализации любой схемы лечения. При таком способе iTreg дифференциации, в результате население наивно, память, эффекторные Т-клетки и iTregs способствовать экспрессии генов или функционального сравнения между популяциями клеток, которые вытекают из одного человека периферической крови доноров. В наших руках, отсортированные клетки былипо сравнению в микрочипов и QRT-PCR анализа для оценки генетических изменений, в западной пятна для изучения ключевых сигнальных событий, или в патче зажима функционально измерения ионных каналов использования ^14.

Наша система предоставляет дополнительные преимущества способность управлять ключевыми аспектами процесса дифференцировки вокруг центральной базы и считывания. Таким образом, можно предварительно сортировать МНПК изменить вход популяция клеток или включают небольшие молекулы ингибиторов и лигандов в среде культивирования. Можно также трансфекции клеток гиперэкспрессией или сбить белок или ввести репортер построить. Как дополнительное преимущество, мы можем изменить условия культуры максимально процент iTregs генерируется. В целом, это человек первичной культуре клеток Т очерчивает очень надежной экспериментальной площадкой с физиологическое значение гораздо больше, чем тех, которые созданы в мышиных систем. Важно отметить, что также может выдержать прямое терапевтическое значение. Действительно, как мест текущей Treg основе терапевтических подходов включают в пробирке или бывших развитие естественных или манипуляции клеток, наша система может рассматриваться как важный канал на пути к включению TREG клеточной терапии в стандарт медицинской помощи. Будущее расширение этой системы будет портной Tregs стать активируется при встрече с конкретным в естественных условиях воспалительный антигенов, а не поликлональной активации описан.